嵌合抗CD20基因工程抗体的构建表达及其功能研究

发布时间：2020-07-10 16:18

【摘要】：本研究采用噬菌体表面显示技术克隆抗CD20抗体轻、重链可变区基因，构建嵌合抗CD20抗体及其Fab'片段，在哺乳动物细胞和大肠杆菌中进行表达；并对Fab'抗体片段的体内外抗瘤活性进行研究，以期将抗CD20抗体HI47推向B淋巴细胞瘤临床治疗应用。 一 轻重链可变区基因克隆及单链抗体库的构建 常规提取HI47杂交瘤细胞总RNA，利用RT-PCR法扩增抗体轻重链可变区基因片段，经Overlap PCR，利用连接链(G_4S)_3基因片段将抗体轻重链基因连接构成单链抗体(ScFv)基因，将ScFv基因重组到pCANTAB 5E载体上，构建抗CD20单链抗体噬菌体文库(约3×10~6克隆)，以表达CD20分子的Daudi细胞为靶抗原，经Panning，ELISA法筛选，获得多个具有CD20结合活性的克隆，对克隆6的基因序列进行序列测定分析，结果显示克隆6的基因序列完符合PDB文库中的抗体基本框架序列，是抗体基因序列。 二 嵌合抗体的构建表达及活性鉴定 利用PCR从表达载体pCANTAB 5Ecd20ScFv上扩增抗CD20抗体轻重链可变区基因，将VH、VL基因克隆到表达载体pYZF中，构建抗CD20抗体表达载体pYZFcd20，并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达Fab'，表达量可达3mg／ml。 本研究对嵌合抗CD20 Fab'片段的体内外活性进行了进一步的研究，竞争性免疫荧光抑制试验结果显示，Fab'特异结合Daudi细胞表面CD20，MTT法测定结果表明，Fab'表达产物抑制Daudi细胞、Raji细胞的生长，IC_(50)分别为69μg／ml、26μg／ml。~3H掺入试验显示，嵌合抗CD20 Fab'不抑制Daudi细胞、Raji细胞DNA合成，但对RNA合成具有抑制作用。以50mg／kg剂量，四天一
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2000
【分类号】：R392
【图文】：

中.勺卜和.再嗽六月州阵d七法将pCANTABSEcd20ScFv质粒转入TGI细菌体抗体库，抗体库的大小约为3x106，即1微隆。第一次pannnig前的文库大小为10“，每次PRc、酶切鉴定，结果表明，随着Pnaning次数均一(图2)，经5轮pnaning后，获得一均一文10，。

BstNI酶切指纹图谱

图4.抗CD20scFv噬菌体文库筛选和阳性克隆的鉴定。EZ、FZ、GZ、HZ为阴性对照;E3、F3、G3、H3为原始库:E4F4、ESFS、GSHS、G6H6、G7H7、GSHS、GgHg、G1H010、GllHll、G12H12挑取6号克隆，利用APAAP法进一步检测其结合活性，达产物能和Duadi细胞特异结合(图5)。E6F6、E7F7、ESFS、G4H4、为随机挑取的克隆结果显示，克隆6的表

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 于乃贻;李华英;傅秀珍;;卵巢恶性淋巴瘤1例[J];潍坊医学院学报;1992年02期

2 邓庆方;β-2微球蛋白:临床重要性及测定[J];国际检验医学杂志;1993年04期

3 王恒湘;孙玉柱;刘春祥;李璞;;21例恶性淋巴瘤的细胞遗传学研究[J];中华医学遗传学杂志;1993年02期

4 崔华，常瑛，王玉华，武佳，段婷;干扰素治疗淋巴瘤的疗效评价[J];中华内科杂志;1994年05期

5 张清河，李长龙，孟沛霖;56例非霍奇金氏淋巴瘤性白血病临床分析[J];白血病;1994年03期

6 ;淋巴瘤患者血清中IL－6的含量及其与伴有B症状的何杰金氏淋巴瘤的生存关系[J];国外医学.免疫学分册;1994年03期

7 文启芬;以神经症状为首发症状的淋巴瘤1例[J];华西医学;1994年01期

8 杨一兵;鼻腔T细胞淋巴瘤表现为中线致死性肉芽肿3例患者淋巴瘤标记特征[J];国外医学.耳鼻咽喉科学分册;1995年02期

9 高玉好,杨连甲,黄高升,马福成,朱萧玲;抗凋零基因Bcl－2产物在口腔粘膜相关性淋巴瘤中的表达及其意义[J];中华口腔医学杂志;1996年05期

10 梁国桢，庄恒国，郭瑞珍，邓飞，张锚链;贵州地区淋巴瘤类型分布[J];临床与实验病理学杂志;1996年04期

相关会议论文 前10条

1 杨华;吕红波;王连有;;儿童非霍奇金淋巴瘤的免疫表型及BCL-2蛋白表达的临床意义[A];第十一届中国抗癌协会全国淋巴瘤学术大会教育论文集[C];2009年

2 施若非;赵肖庆;郑捷;;母细胞性NK细胞淋巴瘤——附二例报告[A];2010全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2010年

3 宋兰云;胡晓丽;赵林胜;宁培儒;;脾外周T细胞淋巴瘤，非特殊类型(巨块型)1例[A];中华医学会病理学分会2007年学术年会暨第九届全国病理大会论文汇编[C];2007年

4 秦伟;屈娅;张海涛;张春梅;;眼眶淋巴瘤的磁共振初步观察[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

5 张桂英;肖嵘;文海泉;陆前进;;原发性皮肤B细胞淋巴瘤1例报道[A];中华医学会第14次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2008年

6 陈志丰;张祥松;;原发性结节淋巴瘤~(18)F-FDG PET/CT影像学特点[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年

7 方建培;黄绍良;黎阳;郭海霞;王潇娉;周敦华;陈纯;;利妥昔单抗联合自体外周血造血干细胞移植治疗儿童Burkitt淋巴瘤[A];第八届全国儿童肿瘤学术会议论文汇编[C];2009年

8 王宗武;张永宏;;胃粘膜相关组织淋巴瘤1例报道[A];2009年贵州省中西医结合消化系病学术交流暨专题学术讲座论文汇编[C];2009年

9 马寒;邵春奎;梁琼;苏祖兰;刘加军;陆春;;胃肠道症状首发伴有皮肤表现的血管内NK/T细胞淋巴瘤一例报告并文献复习[A];2011全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2011年

10 冯琦;孙凯;李红玲;苏明权;刘家云;张新海;张涛;王莎;王玮;孙秉中;;血清、血浆标本IgH基因重排对B细胞淋巴瘤的诊断价值[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年

相关重要报纸文章 前10条

1 沈悌 谢海燕 北京协和医院血液科;注意防范淋巴瘤的袭击[N];上海中医药报;2009年

2 主任医师 佟傟;预防淋巴瘤细节很重要[N];医药养生保健报;2009年

3 孙理　张长鑫 本报记者 赵琳;恶性淋巴瘤到底有多“恶”[N];哈尔滨日报;2009年

4 健康时报特约记者 胡颜　赵迎 陈锦屏 张长鑫;防淋巴瘤多吃碱性食物[N];健康时报;2009年

5 本报记者 于娟;专家教您了解淋巴瘤[N];中国医药报;2009年

6 指导专家 上海第二医科大学附属瑞金医院血液科主任 沈志祥 教授;淋巴瘤康复期 莫小视复诊[N];医药导报;2009年

7 中国医学科学院肿瘤医院副院长 石远凯　浙江大学医学院二附院血液内科主任 张晓红 北京垂杨柳医院中医科主任 赵兰才 北京市肿瘤医院肿瘤康复科主任 章新奇 湖湘中医肿瘤医院放疗科主任 巫爱华;早发现,战胜夺命淋巴瘤[N];中国中医药报;2009年

8 安阳地区医院副院长、主任医师 李新刚;从罗京去世谈淋巴瘤的防治[N];安阳日报;2009年

9 北京朝阳医院骨科副主任医师 康南;骨头上也会长淋巴瘤[N];保健时报;2009年

10 上海中医药大学教授 何裕民;淋巴瘤慎对首次治疗[N];健康时报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 赖增祖;嵌合抗CD20基因工程抗体的构建表达及其功能研究[D];中国协和医科大学;2000年

2 张永清;BCL-6与非霍奇金淋巴瘤的发生及白血病细胞K562分化和凋亡的关系[D];第四军医大学;2002年

3 孙文佶;外套细胞淋巴瘤bcl-1/IgH基因重排及其分子机理的研究[D];浙江大学;2001年

4 刘壮;癌基因MDM2和抑癌基因P53的表达与儿童非何杰金淋巴瘤关系的研究[D];广西医科大学;2002年

5 于锦香;淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤与人类疱疹病毒8的相关性研究[D];中国医科大学;2003年

6 水若鸿;套细胞淋巴瘤形态学、免疫表型和遗传学特征及其诊断价值的研究[D];复旦大学;2003年

7 韩西群;T细胞淋巴瘤TCRγ基因重排特征分析及检测方法的优化[D];第一军医大学;2004年

8 王宏勤;原发性中枢神经系统淋巴瘤的临床病理、免疫表型和bcl-6基因重排研究[D];四川大学;2004年

9 曹阳;淋巴瘤血管内皮细胞异常表达Tim-3:一种新的肿瘤免疫逃避机制的探索研究[D];华中科技大学;2009年

10 陈燕;中国人弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫学亚型、遗传学异常和BCL2蛋白表达机制的研究[D];复旦大学;2009年

相关硕士学位论文 前10条

1 柳刚;淋巴瘤免疫组化和基因诊断标准化的初步研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年

2 于晓明;胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤20例临床分析[D];吉林大学;2004年

3 李辉;淋巴瘤HL和ALCL中c-IAP2与gas1的表达及其相关性研究[D];暨南大学;2002年

4 喻镁佳;As_2O_3抑制人淋巴瘤Raji细胞增殖及VEGF表达[D];昆明医学院;2005年

5 何金杰;原发性胃肠道恶性淋巴瘤36例临床病理分析[D];浙江大学;2008年

6 谭亚敏;高剂量化疗联合自体外周血造血干细胞移植治疗难治性、复发性恶性淋巴瘤[D];浙江大学;2005年

7 刘冬梅;利用组织芯片研究MALT型淋巴瘤中细胞周期与凋亡基因蛋白的表达及意义[D];山西医科大学;2003年

8 杨娟丽;诱导型一氧化氮合酶在小儿恶性淋巴瘤中的表达及一氧化氮对淋巴瘤细胞生长的影响[D];河北医科大学;2005年

9 徐青;眼附属器淋巴瘤的分类，MALT型淋巴瘤的鉴别诊断及其预后指标的研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年

10 谭洁;非霍奇金淋巴瘤患者血清LDH、β_2-MG、CD_（44）、Npt水平的实验和临床研究[D];苏州大学;2002年

本文编号：2749164