多重耐药性大肠埃希菌脂多糖脂质体的制备及免疫保护作用

发布时间：2020-07-10 22:16

【摘要】：目的 鉴于小剂量的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可以增强机体免疫功能,诱导机体的内毒素耐受和抗肿瘤作用,本研究以临床分离的多重耐药性大肠埃希菌LPS制备LPS-脂质体并考察其免疫保护作用,以探索有效预防医院内多重耐药菌感染的新方法和防治肿瘤疾病的新思路。 方法 酶解法提取临床分离的多重耐药性大肠埃希菌TH1、TH2、TH6、TH7、 TH10LPS;鲎变形细胞溶解物试验(Limulus Amebocyte Lysate test,LAL)测定其体外内毒素活性；紫外/可见光扫描测定其吸光度；凝胶色谱法纯化；硫酸-苯酚法测定其糖含量。 逆向蒸发法制备LPS-脂质体,光镜、透射电镜观察其形态,BI-90plus粒径分析仪测定其粒径分布,LAL法测定其内毒素活性及稳定性。 在LPS-脂质体对活菌的免疫保护试验中,用LPS-脂质体免疫小鼠,以100倍细菌LD50(50%lethal dose, LD50)活菌菌液攻击小鼠,观察小鼠存活情况；在LPS-脂质体对LPS的免疫保护试验中,建立半乳糖胺模型使小鼠致敏,计算LPS完全致死剂量(100%lethal dose, LD100),用LPS-脂质体免疫小鼠,以2倍LPS-LD100攻击小鼠,观察小鼠存活情况；在LPS-脂质体对肿瘤的抑制试验中,用LPS-脂质体免疫小鼠,经腹腔注射S180腹水瘤细胞,观察小鼠腹水量及生长情况,经左侧腓肠肌注射S180腹水瘤细胞,观察小鼠实体瘤的生长情况。 结果 LPS提取物冻干后为白色絮状物,溶于水,内毒素活性与Sigma产品相当。 LPS-脂质体常温下呈乳白色悬液,光镜、透射电镜下呈圆形或椭圆形小囊,粒径分布均匀,为(393.542±148.402)nm。与相应的游离LPS比较,LPS-脂质体的内毒素活性降低了102-103。在90天的稳定性试验中,所有样品均未发生内毒素活性的改变；于30天取样进行电镜观察,脂质体形态无明显变化,粒径分析显示其平均值仅有轻度增加,粒径为(432.475±155.148)nm。 在LPS-脂质体对活菌及LPS的免疫保护试验中,①TH1、TH2、TH6、TH7、TH1o单一LPS-脂质体分别免疫小鼠后,相应的活菌和LPS攻击小鼠,试验组的生存率显著高于对照组,差别有统计学意义(P≤0.05),说明TH1、TH2、TH6、 TH7、TH10单一LPS-脂质体对相应活菌和LPS的攻击均有一定的免疫保护作用；②TH1、TH2、TH6、TH7、TH10混合LPS-脂质体免疫小鼠后,TH1、TH7活菌和LPS分别攻击,试验组小鼠的存活率显著高于对照组,差别有统计学意义(P≤0.05),铜绿假单胞菌P7、肺炎克雷伯菌K11活菌和LPS分别攻击,试验组小鼠的存活率与对照组无显著差异(P≥0.05),说明大肠埃希菌混合LPS-脂质体对大肠埃希菌及其LPS的攻击均有一定的免疫保护作用；③TH1、TH7、P7混合LPS-脂质体免疫小鼠后,TH1、TH7、P7活菌和LPS分别攻击,试验组小鼠的存活率显著高于对照组,差别有统计学意义(P≤0.05),K11菌和LPS分别攻击,试验组小鼠的存活率与对照组均无显著差异(P≥0.05),说明TH1、P7、K11混合LPS-脂质体对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及其LPS的攻击有一定免疫保护作用。 在脂质体对腹水瘤的免疫保护性试验中,TH1、TH2、TH6、TH7、TH10单一LPS-脂质体免疫组瘤细胞计数及生成的腹水量均小于对照组,差别有统计学意义(P≤0.05)；另外脂质体免疫组小鼠体重增加大于对照组,差别有统计学意义(P≤0.05),说明TH1、TH2、TH6、TH7、TH10单一LPS-脂质体对腹水瘤细胞有一定的抑制作用。 在脂质体对实体瘤的免疫保护性实验中,TH1、TH2、TH6、TH7、TH10单一LPS-脂质体免疫组小鼠的瘤体积增长速度小于对照组,差别有统计学意义(P≤0.05),说明TH1、TH2、TH6、TH7、TH10单一LPS-脂质体对实体瘤的生长有一定的抑制作用。 结论 本研究中使用的提取方法可获得活性较高的LPS。LPS-脂质体制备方法可行,且毒性小、稳定性好。体内免疫保护试验表明大肠埃希菌单一LPS-脂质体对相应活菌及其LPS的攻击有一定免疫保护作用,对S180瘤细胞的攻击也有一定的保护作用。大肠埃希菌混合LPS-脂质体和TH1、P7、K11混合LPS-脂质体均具有相对较广泛的交叉免疫保护作用和较好的免疫效果。本研究为有效预防医院内多重耐药菌感染和防治肿瘤疾病提供了新方法与新思路。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392
【图文】：

1.2.2.2.1紫外/可见连续光谱扫描图1在256-260nm波长附近的峰值所对应的菌种由上向下依次为THi(0.5mg/mL)、055:B5 (0.5mg/niL)、TH!。（0. 5mg/mL)、TH7 (0.5mg/mL)、肺炎克雷伯菌 Kii (0. 5fflg/inL)o10

THl-LPS溶液在不同浓度不同波长紫外测定线图

图3 TH2-LPS溶液在不同浓度不同波长紫外测定线图 表5 TH6-LPS溶液紫外测定实验结果 浓度 0^ (mg/mL) 256nm 258腿 259nm 260nm 262nm

【参考文献】

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1 臧金灿;;细菌耐药性机制与临床合理用药[J];安徽农业科学;2007年05期

2 张敬如;黄复生;王昆;;全反式维甲酸脂质体制备及稳定性研究[J];第三军医大学学报;2006年08期

3 曾抗,李国锋,许重远,陈志良,王宗发;鬼臼毒素脂质体软膏治疗尖锐湿疣的双盲随机对照试验[J];第一军医大学学报;1998年03期

4 肖萍;无环鸟苷脂质体口服液对动物模型的抗病毒效果观察[J];甘肃医药;1995年03期

5 沈定树,施致远;克雷伯菌致病因子的研究进展[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;2005年01期

6 朱仲生;段丽芳;张卫星;;医院内获得性感染调查及预防措施[J];中国社会医学杂志;2007年01期

7 陈筱瑜;;庆大霉素脂质体的制备及包封率测定[J];海峡药学;2006年06期

8 王国军;叶冬青;;医院感染及其病原微生物的流行现状[J];疾病控制杂志;2007年04期

9 魏育林,李亚俊,罗乃丹,刘轩,戴书静,金恩源;脂多糖致小鼠SIRS和MODS的研究[J];急诊医学;2000年06期

10 许平;张苏明;张艳红;朱莉莉;陈玉华;张翔;;医院感染病原菌分布及耐药性分析[J];江苏预防医学;2008年03期

本文编号：2749524