斑马鱼阿尔茨海默病动物模型的建立

发布时间：2020-07-11 01:48

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是中枢神经系统的进行性退行性疾病,随着世界人口的老龄化,其发病率越来越高,但发病机制尚未明确,所以AD的发病机制以及防治研究非常重要。AD研究的动物模型非常有限。现有的AD模型以鼠模型为主,但其造模时间长和重复性差,无法完全满足AD研究需求。斑马鱼作为一种新型的模式生物,以其胚胎和幼鱼透明易于观察、个体小易于饲养、繁殖周期短、产卵量大、卵子体外受精和发育、对药物及毒物敏感、适合高通量的药物筛选等优点,已成为疾病研究的最佳模式生物之一。目前斑马鱼广泛用于人类疾病的研究中。本实验拟以斑马鱼为模式生物建立AD模型。本实验采用氯化铝溶液浸泡成年斑马鱼来建立斑马鱼AD模型。通过T迷宫、透射电镜观察、HE染色、生化指标测定、RT-qPCR基因转录水平等检测,研究斑马鱼铝模型是否能成为一种新的AD模型。实验结果显示： 1、T迷宫行为学检测,铝模型组斑马鱼最后一次训练进入营养富集区(EC)的潜伏期与首次训练相比显著增加(P0.05),正常对照组斑马鱼最后一次训练进入EC区潜伏期与首次相比极显著减少(P0.01),铝模型组斑马鱼学习与记忆能力受损。 2、透射电镜观察铝模型组斑马鱼脑神经细胞线粒体肿胀,线粒体内嵴数减少或消失；内质网肿胀变形,网池增宽,呈囊泡状样扩张,同时细胞核内出现凋亡小体。 3、HE染色铝模型组斑马鱼端脑内神经元数量比对照组明显减少,表明神经元受损。 4、生化指标结果显示,铝模型组斑马鱼脑组织与正常对照组相比,乙酰胆碱(acetylcholine, Ach)的水解酶乙酰胆碱酯酶(true choline esterase, TchE)舌性显著升高(P0.05),Ach合成的限速酶乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)活性显著降低(P0.05),两者活性间接说明Ach的含量降低,Ach与学习记忆相关,实验组脑内ACh含量不足,导致学习记忆能力下降；氧化应激系统,斑马鱼脑组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性明显降低(P0.01),丙二醛(maleic dialdehyde, MDA)含量明显升高(P0.01),表明铝能诱导脑内自由基的产生,自由基不断累积导致神经元的渐进性凋亡,从而引起神经退行性疾病的发生。 5、AD相关基因转录水平,铝模型组斑马鱼脑内B-淀粉样前体蛋白b(beta-amyloid precursor protein b, appb)和早老素蛋白1(presenilin1, psen1) mRNA转录水平与正常对照组相比显著增加(P0.05),psen2和B分泌酶1(beta-site APP cleaving enzyme, bace1) mRNA转录水平增加不显著(P0.05),这四种基因与AD患者脑内AB生成有关,虽然目前我们还未能有效检测到斑马鱼脑中Aβ斑块的产生,但从基因转录水平预测,斑马鱼脑内可能会有类似AB物质产生；以上结果说明了铝能够诱导斑马鱼神经元受损,学习记忆能力丧失,产生类阿尔茨海默病样病症。表明斑马鱼铝模型可以作为一种新型的AD模型用于阿尔茨海默病研究。本实验在铝模型基础上利用斑马鱼appb启动子调控人APP瑞典型突变基因(APPsw)插入To12转座荧光载体,显微注射斑马鱼受精卵单细胞,建立转基因AD荧光斑马鱼。实验结果显示,本实验成功构建了pTol2-appb-APPsw-CMV-EGFP双启动子载体,通过显微注射,得到的转基因斑马鱼能在脑部,眼睛,心脏和血管等部位表达绿色荧光。将F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交得到F1代,通过PCR及RT-PCR等基因检测,表明外源基因成功整合在斑马鱼基因组中,成功建立了APPsw转基因斑马鱼模型。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R749.16

【参考文献】