恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1的表达及免疫保护作用的研究

发布时间：2020-07-11 16:48

【摘要】：疟疾仍是目前世界上严重影响人类健康的传染病。疟原虫抗药性的产生和迅速扩散以及抗杀虫剂蚊媒的出现和蔓延迫切需要我们寻求新的疟疾防治措施。发展有效的疟疾疫苗是人类控制乃至消灭疟疾的重要途径。恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1（PfMSP1）是当今领先的疟疾疫苗候选抗原，其主要实验依据是来自夜猴攻击试验。用纯化的MSP1天然蛋白免疫的夜猴能部分或完全保护后来同种疟原虫的攻击感染。MSP1特异单抗或多抗能在体外有效抑制疟原虫的生长。 PfMSP1是分子量为185-200KD的糖蛋白，它在裂体增殖时合成，并在裂殖体破裂时被酶解为 4个片段，按其分子量大小分别定名为 MSP1-83、MSP1-31、 MSP1-36和 MSP1-42。FCB株 5kb Pfmsp1基因及其 4个酶解片段基因的人工全合成（选用人密码子）克服了天然 Pfmsp1基因因 A＋T含量异常高（74％）而导致其在异源系统中极不稳定的困难。研究表明，PfMSP1的免疫保护作用依赖该蛋白正确构象的形成，本研究开展了在毕氏酵母系统中表达全长 PfMSP1及其酶解片段，并进行免疫保护作用的研究，取得了以下结果： 1．将 FCB株 5kb PfMSP1全合成基因进行改造，去样其 5’端信号肽序列，增设起始密码 ATG和两端用于克隆的BamHI和 NotⅠ切点序列。改造的 PfMSP1 基因与 pPIC3．5载体连接后转入毕氏酵母 SMD1168中进行胞内表达。结果显示，全长PfMSP1基因在该系统中获得表达，用mAb5．2单抗进行免疫印迹法检测，在经甲醇诱导的样品中出现约200KD的表达条带，而在未诱导和阴性对照中无特异条带出现。用mAb5．2单抗的亲和层析柱能纯化到表达产物，但因胞内表达且产量低，故制备足够蛋白进行免疫学试验仍有相当困难。 2．为弄清 PfMSP1各酶解片段的免疫保护作用，鉴定出有保护作用的片段以代替全长蛋白用于疫苗试验，我们开展了在毕氏酵母中表达 PfMSP1各酶解片段的研究。将4个片段分别插入经改建的pPICZa表达载体中，转入毕氏酵母 SMD1168株进行诱导分泌表达。结果显示，MSP1-42能分泌在培养上清，但表达产物为双带。尽管进行大量筛选和培养条件的优化。均未能检测到其余3个酶解片段的表达。为了解在该系统中产生的MSP1-42重组蛋白的构象，我们15个特异单抗与该蛋白反应，其中10个单抗识别构象表位。结果显示，除2个阴性对照单抗外，其余13个单抗均能与MSPI叶2反应，有3个单抗u．8，13．l和7．3）不能与＊细胞产生的 MSP反应，但能毕氏酵母产生的蛋白反应，这表明在该系统中产生的MSPI－42在构象上更接近天然蛋白。 3．将上述 MSP42重组蛋白与福氏佐剂乳化后免疫家兔，经 4次皮下注射后，其免疫血清中产生了特异抗体。用培养恶性疟原虫为抗原进行间接荧光抗体试验，两只免疫家兔的抗体滴度分别1：2048和1：5 12。用蛋白A柱从免疫血清中分离总IgG，并检测该抗体对疟原虫体外生长的抑制作用。结果表明，佐剂对照组的IgG无任何抑制恶性疟原虫生长的作用，但免疫组IgG显著抑制疟原虫生长，且抑制作用随 IgG浓度增加而增强，在 250 u g加l时，两只家兔互妒的抑 O 抑率分别为96．6洲和85．54％。 4．以上结果显示了 MSP －42能在毕氏酵母中分泌表达，且能形成天然构象，其特异抗体能抑制疟原虫生长。但该序列来自FCB株，目前用于疫苗研究，特别是进行人体攻击试验的标准株为 3D7株。本研究结果显示 3D7株 MSP＊2天然基因不能在毕氏酵母中分泌表达。对此，我们选用毕氏酵母的密码子，重新设计该基因序列，并去掉其中糖基化位点，产生 1202hP 3D，株MSP142全合成基因。采用不对称 PCR法全合成该基因。该合成 MSP．42基因能在毕氏酵母中高水平表达，表达产物为一条带，无降解产物出现。该重组蛋白也能与识别构象表 o 位的单抗反应。该表达菌株 15工罐发酵及纯化工作正在进行中，大量制备 3D，株 MSP＊2重组蛋白为我们开展该抗原的免疫学研究及疫苗有效性试验提供有用的材料
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R382.31

【引证文献】