诺如病毒GⅡ型流行株基因组特征分析及进化机制研究

发布时间：2020-07-16 02:55

【摘要】：诺如病毒（Norovirus, NoV）是全球非细菌性腹泻的主要病因。1968年NoV被首次报道，至上世纪90年代中期GⅡ.4型NoV成为了全球主要流行株，并且此后每隔两三年就产生变异株并引起新一轮传播，因此也被成为“肠胃炎流感”。近年来我国NoV疫情频繁暴发，对抗病毒研究提出了更紧迫的要求，然而NoV体外复制体系的缺乏增加了病毒研究的困难。检测技术的发展，尤其是PCR技术的应用，对NoV传播特点与分布规律研究具有重要意义。同时，PCR技术还促进了NoV序列的积累，这不但有助于了解病毒基因组特征，而且加深对其进化机制的认识。近年来有学者提出，宿主对病毒感染的的免疫保护作用以及人类血型组织抗原作为病毒受体是NoV进化的两大约束性因素。 NoV序列的积累已经成为了病毒进化及抗病毒研究的基础，因此本论文以病毒序列为中心，分别针对检测技术开发、病毒污染调查、基因组序列克隆、病毒序列进化分析等内容展开研究，具体工作如下： 1、NoV检测技术标准化研究。在构建通用性DNA/RNA质控品的基础上，优化并评价了不同引物、不同类型的RT-PCR检测NoV技术，建立了各种方法检测灵敏度的对应关系，为实际工作中选择合适的检测方法提供了参考依据。此外，还比较了不同方法抽提病毒核酸的差异，其中膜纯化方法效果最佳，同时考察了膜层析、超滤浓缩及免疫板捕获病毒等前处理方法回收病毒的效果。 2、广州地区冬季散发性腹泻中病毒感染调查。调查了广州地区冬季散发性腹泻样本中的病毒感染状况，从89份样本中检出9份NoV阳性和32份轮状病毒阳性。对病毒部分聚合酶区及衣壳蛋白区的序列分析显示，所有NoV均为GⅡ基因型，其中GⅡ.4型占5/9，GⅡ.6型占3/9，另外还包括一株GⅡ.b/GⅡ.3重组株。 3、GⅡ型NoV基因组序列克隆与特征分析。建立了一种简单通用的GⅡ型NoV基因组克隆方法，并克隆得到3条我国华南地区不同型别NoV流行株的基因组序列。同时，收集已公布的GⅡ型NoV基因组，分析其不同蛋白编码区的同源性及进化特征差异，结果显示p22蛋白、P2区和VP2蛋白为易变异区域，进一步对以上区域进行系统发育分析，提示VP1与VP2蛋白可能存在共进化现象。 4、GⅡ.4型NoV衣壳蛋白进化分析。收集已公布的GⅡ.4型NoV衣壳蛋白序列，通过多重序列比对筛选病毒进化中出现的信息位点，分析其中的关键位点及其在病毒衣壳上的分布，然后借助同源建模比较不同GⅡ.4型NoV流行株P蛋白的结构差异，计算关键位点的表面积变化情况，从而分析了各位点的氨基酸使用范围，并预测衣壳蛋白上可能的抗原表位。病毒检测技术开发和序列信息积累是NoV研究的重要工具，因此，本论文围绕NoV序列展开研究，建立了标准的RT-PCR检测NoV技术，并应用于临床样本调查，同时克隆、分析了GⅡ型NoV的基因组序列特征，最后对主要流行GⅡ.4型NoV衣壳蛋白序列的进化机制进行探索。NoV高流行性和易变异的特征对认识病毒提出了迫切的需求，本论文关于病毒检测及进化机制的研究不仅有助于预测NoV的进化趋势，也将为开发有效的病毒疫苗和治疗手段提供重要的理论指导。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.25;R3416
【图文】：

诺如病毒（Norovirus, NoV）是全球流行性与散发性急性胃肠炎的主要病因之一，每年至少导致 100 万次病患就诊和 20 万例 5 岁以下儿童死亡，造成巨大的经济损失[4]。1968 年美国俄亥俄州诺瓦克镇暴发肠胃炎疫情，当地一所小学 50%学生和 32%家庭成员出现腹泻或呕吐症状[5]。1972 年 Kapikian 等利用免疫电镜技术观察到了该次疫情的病原，将之命名为诺瓦克病毒（Norwalk Virus）[6]。其后一系列形态相似、同源性高、具有一定抗原性差异的病毒又陆续被发现，国际病毒分类委员会将其统一归为一属，并在2002 年第八次国际病毒命名会议上正式定义为诺如病毒。1.1 病原学NoV 曾被称为类诺瓦克病毒或小圆结构病毒，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒粒子，属于杯状病毒科（Calicivirus）诺如病毒属。NoV 颗粒直径约 27-38nm，无包膜，表面粗糙，分布有 32 个杯状凹陷，呈 T=3 的二十面体对称结构；电镜观察显现为具有典型的羽状外缘且表面有凹痕的小圆状结构病毒。

晶体结构,电镜,病毒,基因型

第一章绪论毒，GII 型中还包括猪源 NoV，GIII 型可感染羊和奶牛，GIV 型感染人、狗和狮子，GV型为鼠源病毒，最近新出现的 GVI 型病毒可以感染人和狗[27]。目前还没有从人类中分离到动物源病毒，但从动物中已经检出人源 NoV，例如从羊粪便中分离得到的 GII 型病毒和人源 NoV 同源性很高[28]，并且人源 GII.4 型 NoV 可以感染无菌猪和牛。人源和动物源 NoV 的 P2 区域结构差异很大，跨种系传播的可能性比较小[29, 30]，但 SARS 与禽流感病毒的暴发提醒广大科研工作者仍要加大病毒的监控力度。每个 NoV 基因组还可进一步分为不同的基因型，目前 GI 型包括 9 个基因型，GII型至少含有 19 个，GIII 型与 GIV 型各含有 2 个，GV 型只有 1 个。根据序列相似性，同一基因型又可进一步分成不同的基因簇，同一基因簇内病毒的衣壳蛋白相似性很大，例如 GII.4 型 NoV 不同簇间核苷酸变异率仅 2%左右[31]。1.2.3 结构蛋白

病毒衣壳蛋白,颗粒结构,颗粒

A:B 形成衣壳表面，通过将 A:B 二聚体插入到 C:C 内壳中形成一个含有突起的紧密衣壳结构。S 和 P 区在结构和功能上是独立的，单独表达 S 区可以形成一个略小的光滑颗粒（约 27nm），与病毒衣壳的内表面相对应，但不能结合病毒受体。Tan 等尝试使用大肠杆菌表达系统制备 VP1 蛋白[47]，尽管不能形成颗粒，但具有与野生病毒相似的受体结合功能和免疫原性。单独表达 P 区域可以形成不同类型的颗粒，包括 P 颗粒（24 聚体，直径约 20nm）[20, 48-50]、小 P 颗粒（12 聚体，直径约 14nm）[51]以及 P 二聚体[47]。原生质谱实验发现，在还原条件下 24 聚体状态的 P 颗粒可以重新形成 12 聚体的小 P 颗粒和其他两种颗粒（18 聚体和 36 聚体）[52]，说明颗粒结构是可以转换的，并均以 P 二聚体作为基础。和 S 颗粒不同的是，以上三种 P 颗粒均可以和受体结合，从而表明 P 区域是病毒的受体结合区域。因此，目前 P 区域被广泛的用于了 NoV的功能研究，而其中 24 聚体的 P 颗粒是被研究和应用最为广泛的，稳定性高、表达量大、易于整合外源抗原、形状较大并具有多价抗原等优点使其成为病毒疫苗制备的重要候选对象。

【参考文献】