人树突状细胞来源的四个新分子的克隆表达和生物学功能研究

发布时间：2020-07-16 05:02

【摘要】：继2000年6月人类基因组框架图绘制完成后，2001年2月研究者又宣布人类 基因组共有32亿个碱基对，约3.4万个蛋白编码基因，其数字远远低于最初预计的 14万个基因。这给我国的基因组研究带来了更大的压力，只有加快研究速度，努力 发现新基因，深入研究和探讨新分子的生物学功能以及对疾病诊断、治疗的意义， 我们才能挤身世界生物科学研究的前沿，形成具有我国自己知识产权的学术特色。 树突状细胞(Dendritic cells，DC)是人体内重要的抗原提呈细胞，本研究所对 DC的分化发育及其介导的肿瘤免疫治疗的研究工作己进行多年，并在此基础上建立 了人树突状细胞基因文库，通过大规模随机测序的方法开展了从DC中克隆新分子 的工作，从2万余条EST中发现了许多新的分子。在本课题中，我们选择其中4个 进行了克隆表达和生物学功能研究。 鸟昔酸还原酶(guanosine monophosphate reductase，GMPR)(EC 1.6.6.8)主要催化 鸟嗓吟核苷酸(GMP)向次黄嘌呤核苷酸(IMP)的转化：GMP＋NADPH＋2H＋→IMP＋ NH4＋NADP＋。该酶所催化的反应对维持细胞内腺嘌呤和鸟嘌呤核苷酸的平衡发挥 着重要作用。细胞内鸟嘌呤核苷酸池的含量与前髓性白血病HL-60细胞的分化密切 相关。我们从人树突状细胞cDNA文库中分离到一个新的全长cDNA，编码一个由 348个氨基酸组成的未知蛋白。该蛋白质与人鸟苷酸还原酶在氨基酸水平上有高达 79%的同源性，并暂时命名为GMPR2。Northern杂交分析显示新分子的mRNA广 泛表达于正常人体组织及多数肿瘤细胞系。将构建的真核表达载体pcDNA3.1－ GMPR2用脂质体法转染COS7细胞，经瞬时表达获得myc-His融合的重组新分子蛋 白。通过生物化学方法，我们证实新分子蛋白具有催化鸟苷酸还原的酶学活性。用 同样的方法将pcDNA3.1-GMPR2转染HL-60细胞，证实其经佛波脂(TPA)诱导向单 核细胞的分化作用明显增强。因此，通过本课题的研究我们发现了一个新的人鸟苷 酸还原酶分子，并且该分子与HL-60白血病细胞的分化密切相关。 6-磷酸葡萄糖胺异构酶(glucosamine-6-phosphate isomerase，GMII)又名 6-磷酸 葡萄糖胺脱氨酶(glucosamine-6-phosphate deaminase，GMPDA)(EC 5.3.1.10)，主要催 化6-磷酸葡萄糖胺分解生成果糖和氨。该反应是N-乙酚-6-磷酸葡萄糖胺分解代谢 二 博」：学位论文 Molecular cloning and characterlzatlon ofnovel proteins derived from human dendrltlc cells． 途径的最后一步，包括6－磷酸葡萄糖胺的醛酮异构和加氨或脱氨过程。人GNPI的 生物学功能尚不明确。有研究者从仓鼠的精细胞中克隆纯化到一种可溶性蛋白 ＊scillin），该蛋白经微注射入小鼠卵细胞内可诱发钙离子浓度的震荡，这一变化与 卵细胞受精时所发生的变化相同。而Oscillin在氨基酸水平上与细菌的GNPI有高达 53％的同源性。从人树突状细胞基因文库中我们分离到一个新的全长CDNA克隆， 编码一个由276个氨基酸组成的未知蛋白。该蛋白质与人个磷酸葡萄糖胺异构酶和 Oscillin在氨基酸水平上均有高达87％的同源性，暂时命名为GamIZ。Northern 杂 交分析显示新分子的znRNA广泛表达于正常人体组织及多数肿瘤细胞系。其组织表 达谱与GNPI不同。通过与前一分子相同的技术路线，我们表达了GWIZ的重组蛋 白，并通过生化法证实该新分子重组蛋白具有催化6－磷酸葡萄糖胺分解生成果糖的 酶学活性。因此，我们认为该新分子是一个新的人卜磷酸葡萄糖胺异构酶，可能是 与GNPI分布在不同组织和肿瘤细胞，并发挥相同催化作用的同功酶。 脂肪酸在线粒体内的p氧化是细胞能量的主要来源。脂肪酚辅酶A脱氢酶归cyl－ coe…e A dehydrogenase，ACDs）主要催化脂肪酸在线粒体内p氧化的第一步，是脂 肪酸氧化的限速酶。特长链酚辅酶 A脱氢酶WLCAD＊EC．3．99．13）主要催化含 14 20个碳原子的特长链酚辅酶A的氧化。由于长链脂肪酸是人类心脏、肝脏、骨骼肌 等组织的主要能源，因此，VLCAD的缺陷常导致严重的新生儿原发性心肌病 kardiomyopathyX 不明原因的新生儿碎死、低酮性低血糖、肝功能衰竭等。我们从 人树突状细胞基因文库中分离出一个新的ACDS家族的同源基因，暂时命名为 ACAD习。该基因包含一个 1866 hp的完整阅读框，共编码 621个氨基酸。ACAD习 与VLCAD有65％的同源性。ACAD－9的W优势表达于人的心脏，骨骼肌、 脑、肾脏及肝脏等组织。通过生化方法证实ACAD－9可以催化软脂酚辅酶A和硬脂 酚辅酶A的p氧化。我们推测，ACAD习是ACDS家族的一个新成员，该基因的突变 可能与新生儿碎死及原发性心肌病的发病密切相关。 细胞死亡有两种不同的机制，坏死和凋亡。它们在细胞形态学和生物化学上有 着明确的区分标准。TNF－0既可以诱导小鼠成纤维肉瘤L929细胞发生坏死，也可以 诱导其发生凋亡。据推测，两种不同细胞死亡方式可能分别山不同的TNF抵抗蛋白 进厅调节。我们分离出一个新的CDNA克隆，它?
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R392.12

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本文编号：2757557