甲状旁腺素相关肽核定位序列和C末端在调节中枢神经系统发育中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-16 23:48

【摘要】：为了明确PTHrP NLS和C末端缺失引起的脑发育障碍是否与神经干细胞自我更新能力降低有关,我们通过原代和传代培养3天龄PTHrP KI (PTHrPNLS和C末端缺失)和WT小鼠海马区来源的神经干细胞,利用神经球计数、BrdU掺入、流式细胞仪分析和Western blot的方法比较分析了PTHrP KI和WT小鼠神经干细胞的表型变化。结果显示：原代和传代神经球形成效率及传代／原代神经球比例在PTHrP KI小鼠较WT小鼠明显降低；神经干细胞增殖在PTHrP KI小鼠较WT小鼠明显降低,而神经干细胞凋亡在PTHrP KI小鼠较WT小鼠明显增加；CDK2和CDK4表达水平在PTHrP KI神经干细胞中显著下调；而p16、p21和p27以及Caspase-3在PTHrP KI神经干细胞中显著上调。这些结果说明：PTHrP NLS和C末端能够通过激活细胞周期依赖性激酶CDK2和CDK4,抑制p16、p21、p27,促进神经干细胞增殖,抑制凋亡,而发挥维持神经干细胞自我更新能力的作用。 为了明确甲状旁腺素相关肽PTHrP NLS和C末端缺失对脊髓发育的影响,我们利用组织学、免疫组织化学和分子生物学等方法,比较分析了1周或2周龄PTHrP KI和同窝WT小鼠脊髓的表型差异。结果显示：PTHrP KI小鼠脊髓长度变短,重量减轻,颈段和腰段脊髓横切面截面积变小。NeuN阳性细胞百分率在PTHrP KI小鼠脊髓中明显减少；MBP阳性少突胶质细胞面积和髓鞘形成数目在PTHrP KI小鼠脊髓中明显减少。PCNA阳性神经细胞百分率在PTHrP KI小鼠明显减少；Cyclin D1、CDK4和CDK6mRNA表达水平和Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6蛋白表达水平在PTHrP KI小鼠脊髓中明显下调,而p16、p19、p21和p27基因和蛋白表达水平在PTHrP KI小鼠脊髓中均明显上调；这些结果说明：PTHrP NLS和C末端能够通过促进脊髓神经干细胞增殖,诱导其向神经元和少突胶质细胞分化,加速髓鞘形成,而发挥促进脊髓发育的作用。 为了研究p27是否作为PTHrP NLS的下游靶标之一参与了PTHrP NLS对脑发育的调节,我们建立了p27-/-KI小鼠模型,运用组织化学、免疫组织化学和Western Blot等方法,比较分析了2周龄p27-/-KI小鼠与同窝p27-/-、PTHrPKI及WT小鼠脑的表型差异。结果显示：p27基因敲除能够延长PTHrP KI小鼠生存期,并改善其生长发育；增加PTHrP KI小鼠脑重,改善其脑形态发生异常；上调CyclinD1,下调p19和p53,促进PTHrP KI小鼠脑各部神经细胞增殖；促进PTHrP KI小鼠脑各部的神经元分化,改善小脑外颗粒层神经细胞的迁移和成熟；增加PTHrP KI小鼠脑各部GFAP阳性星形胶质细胞和MBP阳性少突胶质细胞面积。Shh通路相关分子Shh、Smo、Gli1/2和Bmi-1表达水平在p27-/-小鼠脑组织中明显上调；在PTHrP KI小鼠中明显下调,而敲除p27能够上调这些分子在PTHrP KI小鼠脑组织中的表达。这些结果说明：p27能够通过激活Shh通路,促进神经干细胞增殖,诱导其向神经元和胶质细胞分化,而发挥改善PTHrP NLS和C末端缺失引起的脑发育障碍。 本研究结果不仅进一步阐述了PTHrP NLS和C末端在调控中枢神经系统发育中的作用机制,也为将PTHrP NLS和C末端应用于促进神经再生的临床研究提供实验和理论依据。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R338
【图文】：

图1 PTHrP N-末端、中间段、核定位序列和C末端功能及信号通路图为了研宄PTHrP确切的生理功能，Karaplis]3等利用胚胎干细胞同源基因重组技术，建立了 PTHrP基因敲除小鼠。PTHrP纯合子小鼠出生后不久即死于窒息，呈现明显的软骨发育不良。该研究指出，PTHrP在胚胎发育期最明显的作用是刺激软骨细胞的增殖、抑制软骨细胞的分化和凋亡。在细胞内信号传递网络中，由NLS引导的蛋白入核是核内外物质进行信息交流的重要环节，在细胞的增殖、分化、阔亡和转化中发挥着关键作用。对于PTHrP核定位序列（NLS)的研究始于1995年，Henderson丨4等的研究证实PTHrP含有NLS，该序列可以将异源性胞團蛋白输送到细胞核并有抗细胞凋亡作用。在血管平滑肌细胞（VSMCs)，PTHrP的NLS可通过细胞内分泌方式促进VSMC增殖，而N-末端和中间区无刺激VSMC增殖作用。但仅有NLS却

基因型鉴定

图3 PTHrP KI对小鼠的脑外形和形态学变化的影响(A)3天龄WT和KJ小鼠脑大体照和（B)脑重，（C) HE染色脑矢状面显微图像（12.5X)。*: p<0.05,与 WT 小鼠相比。2. PTHrP NLS和C末端缺失对神经干细胞自我更新能力的影响为了明确PTHrP NLS和C末端缺失导致的小鼠脑发育异常是否与神经干细胞自我更新能力降低有关，我们从3天龄PTHrP KI和WT小鼠脑海马区分离神经细胞，进行原代及传代培养，观察神经球形成效率，并利用图像分析对yL经球进行计量分析。我们分析了原代yL经细胞培养3天、6天、9天时神经球的形成情况，并对培养9天形成的神经球根据大小进行了计量分析。结果显示：神经球形成数目在3、6和9天野生型和PTHrP KI小鼠神经细胞培养中均逐渐增加，

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 郭乐深;刘锦德;;高可用CORBA[J];计算机科学;2000年02期

2 王明文;孙永强;;可移动代码的一种优化技术[J];计算机科学;2000年01期

3 Li He;Q.Richard Lu;;Coordinated control of oligodendrocyte development by extrinsic and intrinsic signaling cues[J];Neuroscience Bulletin;2013年02期

本文编号：2758677