家蚕杆状病毒表面展示SARS-CoV N、RBD蛋白及其免疫原性研究

发布时间：2020-07-17 00:19

【摘要】：严重急性呼吸综合征（SevereAcute Respiratory Syndromes），又称传染性非典型肺炎，简称SARS，是一种因感染SARS-CoV引起的新呼吸系统传染性疾病。 本实验尝试利用家蚕杆状病毒表面展示技术将SARS-CoV主要结构蛋白N蛋白（Nucleocapsid protein）及S蛋白（Spike protein）的受体结合区域（Receptor Binding domain即RBD）共展示在杆状病毒囊膜表面，通过低离、高离、超离等步骤纯化，得到纯重组杆状病毒vBmgp64-N-RBD，灭活后免疫BALB/c小鼠获得抗血清，并对其免疫原性进行初步研究，为SARS双价基因工程亚单位疫苗奠定一定的基础。同时构建重组杆状病毒vBmgp64-N、vBmgp64-RBD，后续工作同vBmgp64-N-RBD，通过比较三种免疫抗血清，研究三种重组杆状病毒的免疫原性。首先运用E. coLi BL21表达系统，分别表达SARS-CoVN蛋白和RBD蛋白，镍柱亲和层析法纯化目的蛋白，得到高纯度N蛋白和RBD蛋白，分别免疫新西兰雄兔制备多克隆抗体，抗体经纯化后间接ELISA法测定其效价，N蛋白免疫获得的抗血清达1∶25600，RBD蛋白免疫获得的抗血清达1∶12800；然后利用Bac-to-Bac系统获取重组杆状病毒vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD，经SDS-PAGE、Western Blotting鉴定及激光共聚焦显微镜分析，结果表明三种重组杆状病毒相应的目的蛋白均成功表达展示于BmN细胞质膜上，三种灭活的纯重组杆状病毒粒子免疫BALB/c小鼠，初步研究目的蛋白的免疫原性，三种重组杆状病毒免疫小鼠获得的相应多抗效价均可达1∶6400，中和实验结果显示vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD免疫小鼠获得的抗体中和效价分别为1∶16、1∶48、1∶50，说明N、RBD蛋白具有较好的抗原性且获得的抗体效价较高。 本实验首次用表面展示技术在BmN细胞中开发新疫苗，进行了SARS疫苗研制新途径的尝试并取得了较好的初步结果，为后续疫苗的研究开发奠定了基础，且具有SARS疫苗方法学上的创新性。
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【图文】：

SARS-CoV结构

图 1.2 SARS-CoV 周期Fig. 1.2 The replication cycle of SARS-CoV1.2 SARS-CoV 的结构蛋白及其各自的功能1.2.1 棘突蛋白（Spike protein）棘突蛋白（Spike protein）：是受体结合位点及主要抗原位点。S 蛋白在 SARS-Co子表面形成花瓣状突起，pH 值为 6，弱酸性跨膜糖蛋白，核酸序列长 3768 bp，含 12氨基酸，是目前最大的病毒结构蛋白[9]，是 SARS-CoV 与宿主细胞受体结合、膜融合细胞过程的关键蛋白，也是 SARS-CoV 主要的抗原蛋白。S 蛋白前体最终形成两个结S1 和 S2，S1 为成熟蛋白的球状部分，参与病毒和受体的识别结合；S2 为棒状部分，膜把整个 S 蛋白固定在病毒外壳膜，以便于 S 蛋白与宿主细胞膜融合。此外，S 蛋白

浙江理工大学硕士学位论文 家蚕杆状病毒表面展示 SARS-CoV N、RBD 蛋白及其免疫原性研RBD 基因序列是 S 蛋白的 212~550 氨基酸区段，RBD 蛋白的等电点为 8.3，偏碱性蛋白分子量为 38 KDa，疏水性氨基酸较多，不存在信号肽序列和跨膜区，17 个磷酸化位点

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

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本文编号：2758712