死亡受体6相互作用蛋白质的筛选与鉴定

发布时间：2020-07-17 11:33

【摘要】：肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)及其相应的受体超家族(TNFRSF)在细胞功能调控方面具有重要地位，其调控作用涉及细胞的多种行为，与机体的生理和病理过程密切相关。截止目前，至少对19种配体和29种受体进行了深入地研究。死亡受体6(DR6)，即TNFRSF21，是新近发现的TNFRSF成员，但其相应的配体至今没有报道。本研究首先采用细菌双杂交系统在人肝细胞cDNA文库中筛选得到了可能与DR6相互作用的分子，对其中的hepsin与maspin进行了重组表达，在胺化磁珠上证实了重组蛋白与DR6的结合。本研究还编写了基于蛋白质密码理论的多肽筛选软件，应用该软件从hepsin与maspin分子中筛选到了可能与DR6相互作用的多肽序列，选择合成了其中部分多肽，在细胞模型上观察到了这些多肽诱导细胞凋亡的作用。这些结果表明：hepsin与maspin可能为DR6的配体或相互作用蛋白。一、细菌双杂交系统在细胞外蛋白质相互作用研究中的应用利用已知的TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)与其3个受体(DR4、DR5、OCIF／OPG)相互作用的关系，分析细菌双杂交系统研究细胞外蛋白相互作用的可行性。以带四环素(T)抗性的pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域表达质粒；以带氯霉素(C)抗性的pBT构建编码DR4，DR5，OCIF／OPG的细胞外区域序列质粒。所构建的质粒分别相应共转化带卡那霉素(K)抗性的报告菌株XL1-Blue MRF，铺于含250～500μg／ml羧苄青霉素(C)，15μg／ml四环素(T)，34μg／ml氯霉素(C)，50μg／ml卡那霉素(K)的15 cm的LB平皿(LB-CTCK)，即报告基因产物以抗羧苄青霉素作为转录激活的指标，然后再以β-半乳糖苷酶活性进行验证。所构建的pTRG-TRAIL与pBT-DR4，pTRG-TRAIL与pBT-DR5及对照组分别共转化后，在500μg／ml羧苄青霉素的LB-CTCK筛选下宿主菌呈转录激活状态，pTRG-TRAIL与pBT-OPG组共转化后在250μg／ml羧苄青霉素筛选下宿主菌呈转录激活状态。阳性克隆皆可在X-Gal-PETG-TCK平皿可以进一步验证。对照组pTRG-TRAIL与pBT-LGF2，pBT-DR4与pTRG-Gal11，pBT-DR5与pTRG-Gal11或pBT-OPG与pTRG-Gal11四组共转化后呈阴性。由于所用的双杂交序列皆为编码TRAIL受体的细胞外区域，而这些蛋白质之间王粤华博士学位论灰死亡受体6相王作用蛋白质的饰迄与鉴定的相互作用已有验证，由此证实了细菌双杂交可以用于细胞外蛋白质相互作用的研究。同时证实了OCIF/OPG与TRAIL能直接结合，但亲和力较TRAIL与DR4、TRAIL 与DRS要低。二、细菌双杂交系统筛选与DR6相互作用的分子以pBT构建编码DR6细胞外区域(43一234aa)与Fc片段融合表达的质粒，与 Stratagene公司购买的细菌双杂交用人肝细胞cDNA文库(以pTRG构建)共转化 xLI一Blue MRF，铺于250协g/m1梭节青霉素的LB一cTCK平皿。24h后长出大量菌落 (300个/平皿)，随机挑选10个克隆进行测序，结果显示筛选到的主要是与Fc片段结合的蛋白编码序列。提高梭节青霉素浓度至500卜g/ml阳性克隆略有减少(约100 个/平皿)。将DR6细胞外区域编码序列直接插入pBT，按上述方法在500林g/ml羚节青霉素的LB一CTCK平皿上筛选了8轮次，共计360余块15 cm平皿，每次的转化效率在 2x107一6xlo7间。结果共得到1200余个阳性克隆，用x一Gal一PETG平皿进一步验证，得到了约300个阳性克隆，全部进行了插入片段的序列分析。剔除已知只存在于细胞内(如核内、胞浆、线粒体等)的蛋白编码序列，共12次得到抗胰蛋白酶(alphal 一antitryPsin)，4次hePsin，2次未知的同一新基因，2次白蛋白，2次补体IY亚单位， 2次转铁蛋白(ferritin)及maspin、克隆刺激因子1受体、A一n脂蛋白、c脂蛋白、 C反应蛋白、视黄酸受体a、血清类粘蛋白1、血清素等编码序列各1次。调研文献分析所报道这些蛋白的功能和研究现状，选择了H型跨膜蛋白丝氨酸蛋白酶家族分子 hePsin与丝氨酸蛋白酶抑制剂家族分子maspin进行进一步研究。三、重组表达hcPsin与masPin，胺化磁珠法分析与DR6的结合设计相应的引物，以肝细胞cDNA文库为模板，PCR扩增了其中的 hePsin细胞外区域和maspin成熟肤的编码序列，插入pMALTM Protein Fusion and Purifieation System(New England Biolabs公司)中的pMAL一eZ载体，进行与麦芽糖结合蛋白 (MBP)融合的原核重组表达。表达产物用试剂盒所带的直链淀粉亲和层析柱初步纯化，达到电泳纯。DR6细胞外区域同样表达并纯化。将hepsin、maspin及MBP蛋白分别共价结合于旺源胺化(NHZ一terminated)磁珠 (云南旺源生物科技有限公司，WB 130)上，再用过量的人血白蛋白饱和磁珠。各组各分成2管，1管加入适量纯化的重组表达的DR6，另l管以MBP为对照，4℃轻摇王架毕博士檬位论失死亡受体6相王作用番白质的拜透与鉴定 lh。分别分析DR6、MBP加入前、后蛋白浓度的变化。结果DR6浓度在hepsin与 ma印in实验组显著降低，而MBp浓度基本无变化，说明DR6与hepsin或maspin能相互结合。四、基于蛋白质密码理论编写分析软件，以验证masPin和hcPsin中与DR6的结合区域蛋白质密码理论认为，蛋白质分子相互识别的信息储存于它们的编码DNA序列中，编码受体/抗原基因的反义核营酸序列中的
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R341
【图文】：

编码序列,重组子,编码片,双杂交

以本室构建的pMD一OCIFm为模板，pl、pZ为引物，peR扩增oeIF/opo编码序列，EcoR工、BamHI双酶切片段和相应载体pBT，T4DNA连接，酶切鉴定结果如图1一3，可见酶切出1kb左右的OPG编码片段。说明得到了细菌双杂交所需的pBT-oPG融合表达载体。‘万日五~J、钊夕皿、，三玉三二」1咤凡‘叼之2少毛甲戈「孚牙岁J压亿人七Figl一3PBT-OPGdigestedwithEeoR1andBamHI:PBT-OPGdigestedwitllEeoR1andBamHI:M:GeneRuler100bPDNAladderPlus

编码序列,平皿,阳性克隆,编码片

华博士学位论义死亡受体6相王作用蛋白质的饰迄与鉴定图1一2酶切分析重组子Figl一2ldentifieationofreeombinantPlasmidsbyEcoR1andBamHIM:GeneRuler100bPDNAladdel·Plus:l一2:PBT-DR4andPBT-DRSdigestedwithEeoR1andBamHI3:PTRG一TRAILdigestedwitllEeoR1andBa一nHI(二)入Cl一OCIF/OpG融合表达质粒pBT-OpG的构建以本室构建的pMD一OCIFm为模板，pl、pZ为引物，peR扩增oeIF/opo编码序列，EcoR工、BamHI双酶切片段和相应载体pBT，T4DNA连接，酶切鉴定结果如图1一3，可见酶切出1kb左右的OPG编码片段。说明得到了细菌双杂交所需的pBT-oPG融合表达载体。‘万日五~J、钊夕皿、，三玉三二」1咤凡‘叼之2少毛甲?

序列,酶切鉴定,细胞外区,直接插入

(约100个/平皿)，但总量太多还是无法分析。用P3、P4引物，以pCMV-Flag一DR6EcD一F。为模板扩增出DR6细胞外区域编码序列，直接插入pBT，经酶切鉴定(图1二5)与序列分析(图1一6)。图1一5酶切鉴定pBT-nR6Een一FeFigl一5IdentifieationofreeombinantPlasmidsbyEeoR1andBamHIM:GeneRuler100bPDNAladderPlus::PBT-DR6ECD一FedigestedwithEeoR1andBamHI2:PBT-DR6ECDdigestedwithEeoR1andBamHI

【引证文献】