间充质干细胞在辐射损伤后干性维持的机制研究

发布时间：2020-07-18 23:05

【摘要】：干细胞(Stem cells)是一类可以进行自我更新、长期存活、在特定的生理或者实验培养条件下,定向分化为功能特定的细胞。干细胞具有两大重要特征:自我更新能力和分化潜能。自我更新是干细胞在未分化状态下不需谱系定型的增殖。分化潜能指未分化的干细胞分化为各种类型的细胞。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，可向多种中胚层组织细胞分化，如软骨细胞、成骨细胞及脂肪细胞等多种成体细胞。MSCs最早发现于骨髓，同时也存在于其它组织中如脂肪组织和脐带等。MSCs除了支持造血、免疫调节和多向分化的特性外,还具有靶向迁移到损伤组织、慢性炎性反应部位及修复损伤组织的特性。当MSCs的干性受到损伤时会丧失对造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）的支持作用，受损伤的组织不能正常修复，引起组织衰老甚至肿瘤形成。自噬(autophagy)是真核细胞通过降解其自身的细胞质或细胞器实行“自我消化”的一系列生化过程。自噬可以作为一种防御机制清除胞质内受损的细胞器、代谢产物，进行亚细胞水平上的重构，保护受损的细胞。饥饿被认为是对自噬发生最有效的外源性刺激。在饥饿状态下，细胞发生自噬，降解细胞质内的蛋白质，进行糖酵解，从而为细胞提供能量。自噬在干细胞的干性维持中也起着重要作用。最新的文献显示，自噬对干细胞的自我更新和分化潜能是必要的。研究报道在造血干细胞(HSCs)中自噬的作用，发现当造血干细胞缺失自噬相关基因ATG-7时，造血干细胞不能存活，并且也失去了部分自我更新的能力和向造血细胞分化的潜能。也有研究者发现采用3-MA、ATG5-shRNA分别抑制自噬后，造血干细胞、表皮干细胞、真皮干细胞都丧失了自我更新和分化潜能。那么，当MSCs干性受到损伤时，自噬是否也参与了细胞对损伤的抵抗，从而能维持其干性。当细胞受到电离辐射会产生大量的活性氧化物（Reactive oxygen species，ROS），如果细胞内ROS产生过量，就使得ROS在胞内蓄积从而引起氧化应激。为保护细胞对抗氧化应激反应，多种防御机制启动，如抗氧化物表达的上调，泛素-蛋白酶系统清除交联蛋白和自噬清除损伤的蛋白和细胞器官。当细胞受外界刺激产生大量ROS时，ROS及其它物质可以通过优先激活线粒体自噬选择性地降解氧化损伤的线粒体，从而减轻其对细胞的损害。有研究报道T淋巴细胞缺少自噬相关基因ATG5、ATG3或ATG7时，会出现异常线粒体积累和内质网扩张，导致细胞内ROS产物增多，T淋巴细胞受损。大量研究已证实自噬在干细胞中调节线粒体数目和ROS水平中也发挥重要作用。ATG7缺失的造血干细胞中出现大量异常线粒体积累，ROS产生增多， DNA损伤加重，最终导致ATG7缺失的造血干细胞出现异常增殖。自噬缺乏的iPS细胞中ROS产生增多使自我更新能力下降。因此，自噬对间充质干细胞的干性维持的保护作用是否是通过清除电离辐射损伤的线粒体，使ROS产生减少，减轻细胞DNA损伤，从而使得间充质干细胞在受电离辐射后干性得以维持呢? 为研究自噬在间充质干细胞辐射损伤后干性维持中的作用及机制，本课题将从以下三方面展开：第一部分研究辐射对间充质干细胞干性维持的影响；第二部分研究自噬在间充质干细胞辐射损伤后干性维持中的作用；第三部分研究自噬参与间充质干细胞辐射损伤后干性维持的机制。第一部分辐射对间充质干细胞干性维持的影响首先将MSCs置于电离辐射下，观察电离辐射对MSCs干性维持的影响。研究结果表明：X-ray辐照后，MSCs表面标志物CD105、CD90和CD29与对照组相比表达下降。经辐射的MSCs克隆集落形成数目较对照组明显减少。Real-time PCR结果显示，辐射的MSCs中与干性相关的核转录因子Nanog, Oct4和Sox2的表达较对照组显著降低。上述结果提示电离辐射损伤了MSCs的自我更新能力。诱导分化研究表明：X-ray辐照后的MSCs中成骨相关标志物ALPL, OGN和转录因子RUNX2-mRNA的表达下调。细胞茜素红染色可见辐射后的MSCs形成的钙结节数目明显较对照组减少。X-ray辐照后的MSCs中成脂相关标志物LPL, CFD和转录因子PPAR-γ-mRNA的表达也同样下调。且经辐射的MSCs诱导分化后油红O染色形成的脂肪滴数目较对照组减少。结果证明，电离辐射损伤了MSCs的成骨、成脂分化的潜能。上述结果提示：电离辐射不仅损伤MSCs的自我更新能力，也损伤了多向分化潜能，使MSCs干性丧失。第二部分自噬在间充质干细胞干性维持中的作用研究以无血清培养基培养MSCs作为诱导自噬发生的外源性刺激，饥饿预处理后再予以X-ray照射，观察MSCs干性维持的情况。结果表明，饥饿预处理的MSCs辐射后克隆集落形成数目增加，转录因子Nanog, Oct4and Sox2表达上调，自我更新能力提高。诱导分化实验也观察到了同样的结果，饥饿预处理的MSCs辐射后，可发现成骨、成脂分化潜能增高。由于自噬可以作为一种防御机制保护受损的细胞，我们研究了MSCs在饥饿预处理后能够逆转辐射对其干性维持的损伤是否为自噬介导。与预期结果一致，饥饿预处理后MSCs中自噬发生。然后我们进一步利用自噬抑制剂3-MA和CQ处理MSCs，从而抑制饥饿诱导的自噬，再检测自噬抑制后辐射损伤对MSCs干性维持的影响，结果显示，抑制自噬后辐射对饥饿预处理的MSCs自我更新及成骨、成脂分化潜能的损伤加重。上述结果提示，自噬逆转了辐射对MSCs自我更新能力和分化潜能的损伤，使其维持干性得以维持。第三部分自噬参与间充质干细胞辐射损伤后干性维持的机制研究以无血清培养基培养MSCs作为诱导自噬发生的外源性刺激，饥饿预处理后再予以X-ray照射，采用细胞免疫荧光技术检测饥饿预处理的MSCs接受辐射后ROS产生的数量及DNA损伤的情况，并用流式细胞仪检测了线粒体ROS产生的数量及线粒体膜电位的变化。研究结果提示饥饿预处理的MSCs接受辐射后较单纯辐射组ROS产生减少，线粒体ROS减少，线粒体膜电位上升，DNA损伤减轻。我们进一步用自噬抑制剂3-MA和CQ抑制自噬后，观察饥饿预处理的MSCs接受辐射后ROS产生的数量及DNA损伤的程度，发现抑制自噬后，饥饿预处理的MSCs接受辐射后较对照组ROS产生增多，DNA损伤加重。研究结果证实，间充质干细胞自噬的发生，清除了电离辐射损伤的线粒体，导致ROS产生减少，减轻了细胞DNA损伤，从而使得间充质干细胞在受电离辐射后干性得以维持。综上所述，我们的研究结果提示如下结论： 1、电离辐射不仅损伤MSCs的自我更新能力，也损伤了多向分化潜能，使MSCs干性部分丧失。 2、细胞内自噬减轻了辐射对MSCs自我更新能力和分化潜能的损伤，使其干性得以维持。 3、间充质干细胞自噬发生清除了电离辐射损伤的线粒体，ROS产生减少，减轻了细胞DNA损伤，从而使得间充质干细胞在受电离辐射后干性得以维持。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【图文】：

自噬,干性

减少症[26,27]。Atg7-/-造血干祖细胞可以明显地累积更多异常的线氧水平，DNA 损伤和 CASPASE3 激活的凋亡（图 2）。而且那些二次克隆。另外，在一个评价那些细胞的重建能力的试验中，Va细胞被移植到 CD45.1+的辐照过的受体内后，不能够保持长期的体动物在四周内死亡。总而言之，这些结果显示自噬对于维持 H。研究者还观察到在 Vav-Atg7 - / - 小鼠的脾脏和骨髓中髓系细胞比例是增加的，这就提示有非典型性的骨髓增生。实际上，那些细物）阳性的，而且骨髓增生在所有的 Vav-Atg7 - / -小鼠的髓系和这些结果提示在 Vav-Atg7 - / -小鼠中异常的线粒体清除被削弱，导而 DNA 损伤和基因改变，这些都可以说明 Vav-Atg7 - / -的 HSPCs究都支持自噬在防止基因组不稳定，维持成体造血干细胞增值，以减少症和癌症中的发挥着明确作用。

超氧化物,DNA损伤,线粒体,异常的

2.Atg7 -/-造血干祖细胞聚积异常的线粒体，增加超氧化物，DNA 损伤和凋亡的形成。噬在干细胞分化中有细胞重塑的作用如前面所述，自噬是通过降解细胞内受损和蜕变的某些细胞器和蛋。近期有研究表明当 T 淋巴细胞缺失自噬相关基因 Atg3, 5, 7 后，由细胞稳态引起异常线粒体和内质网的积累，ROS 生成增多，细胞内钙步减弱钙平衡，影响 T 淋巴细胞的存活[28-30]。自噬除了在细胞分化中起到“清道夫”的作用，并且通过细胞重塑构的变化进一步参与到细胞的分化中。在成脂过程中，前脂肪细胞可并且使甘油三酯积聚为大的单腔脂滴[31]。Singhd 等[32]报道前脂肪细因 Atg5、Atg7 或者用自噬抑制剂 3-MA 处理后，脂肪细胞分化的标油三酯积累减少，而且这些脂肪细胞形成小的多泡脂滴而不是大的单

【共引文献】