多房棘球绦虫亚单位疫苗及DNA疫苗初步研究

发布时间：2020-07-19 09:52

【摘要】： 目的 构建多房棘球绦虫elp基因原核表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化重组蛋白；构建elp基因真核表达载体，在哺乳动物细胞COS7中瞬时表达以验证其表达能力，纯化重组质粒；以原核表达重组蛋白为亚单位疫苗、真核表达质粒为DNA疫苗免疫动物，观察实验动物产生的免疫应答；比较2种疫苗的免疫效果并观察弗氏佐剂对亚单位疫苗和小鼠IL-12真核表达质粒对多房棘球绦虫DNA疫苗的佐剂作用。 方法 人工感染沙鼠，收集多房棘球绦虫续绦期幼虫（EMML）。用核酸纯化试剂盒抽提EMML总RNA。从GenBank获得多房棘球绦虫elp基因cDNA序列（EM10,EMⅡ/3），设计合成PCR引物并引入内切酶位点，用RT-PCR方法从EMML RNA制备目的基因。与此同时，比较了5种核酸提取试剂盒制备RNA的效果和不同DNA聚合酶对长片段DNA的扩增效果。应用分子克隆技术，将RT-PCR扩增产物插入克隆载体pGEM-11zf并进行测序和序列分析。 应用亚克隆技术将含有多房棘球绦虫elp基因完整编码区的DNA序列亚克隆于原核表达载体pET32a(+)和pQE30(+)。以IPTG进行诱导表达，Western blot进行鉴定。 将目的基因亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+)。将elp基因真核表达重组质粒电转染哺乳动物细胞COS7。RT-PCR检测COS7细胞中elp WP=14 基因转录产物，Dot-ELISA和免疫组化方法鉴定elp基因表达产物。 大量纯化在大肠杆菌中表达的ELP重组蛋白和elp基因真核表达质粒。将72只4-6w龄BALB/c小鼠按雌雄各半分为7组（前6组10只/组，最后1组12只）。A组：每鼠用ELP重组蛋白100μg；B组：每鼠用ELP重组蛋白100μg与等体积弗氏佐剂混合（首次为弗氏完全佐剂、第二三次为弗氏不完全佐剂）；NS组：生理盐水对照；Ⅰ组：每鼠用真核表达空质粒（pcDNA3.1(+)）100μg、0.75%布比卡因480μl；Ⅱ组：每鼠用elp基因真核表达重组质粒（pcD-ELP）100μg、布比卡因480μl；Ⅲ组：每鼠用小鼠IL-12真核表达重组质粒（pIL-12）100μg、布比卡因480μl；Ⅳ组：每鼠用pcD-ELP 100μg、pIL-12质粒100μg、布比卡因480μl。A组和B组采用多点皮下注射；NS组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组均用NS调整至终体积140μl，双侧股四头肌肌肉注射（每侧70μl）。各组均免疫3次，间隔2w。 ELISA方法检测免疫前（0w）和免疫后不同时间（首次免疫后2w、4w、6w、7w）特异性IgG1，IgG2a和IgG2b水平。双抗体夹心ELISA试剂盒检测首次免疫后7w各组鼠脾脏单个核细胞（PMNC)在受到特异抗原刺激后，产生IL-4、IL-12和IFN-γ的能力，3H-TdR掺入法检测脾淋巴细胞的增值能力。 结果 5种商品化试剂盒或试剂中，总RNA提取试剂盒（RNeasy Total RNA Kit）效果最好。只有该试剂盒提取的EMML RNA电泳显示出清晰的28 S、18 S rRNA条带和弥散于0.8kb至20kb之间未降解的mRNA，是唯一能逆转录扩增出单一目的条带的核酸提取物。Taq DNA聚合酶与高保真DNA聚合酶Pfu的混合制剂Taq Plus应用于RT-PCR可扩增出大量1760bp WP=15 单一目的基因。克隆测序和序列分析发现，EMⅡ/3和EM10是多房棘球绦虫elp基因组基因不同的cDNA克隆，本研究构建的重组质粒pEM10sc-11zf插入片段含有完整的elp编码区，并且与GenBank中EM10编码区只有一个碱基不同，即第869碱基分别为G和A，翻译后第290位氨基酸分别为精氨酸 （CGT）和组氨酸 （CAT）。 酶切鉴定显示本研究已将elp基因编码序列成功地亚克隆于pET32a(+)和pQE30(+)的多克隆位点，构建了能表达目的蛋白/硫氧环蛋白（Trx）融合蛋白的原核表达重组质粒pETrx-ELP和原核非融合表达重组质粒pQ-ELP。SDS-PAGE及Western blot分析两个重组质粒在IPTG诱导下分别高效表达了83kDa Trx/ELP融合蛋白和67kDa ELP重组蛋白，分别占菌体总蛋白的23%和14～17%。经亲和层析，67kDa大小的ELP重组蛋白达到90%以上。 酶切分析证实多房棘球绦虫elp基因编码区已亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+)，成功地构建了真核表达重组质粒pcD-ELP。RT-PCR、dot-ELISA和免疫组化证实，重组质粒在哺乳动物细胞COS7中能够表达多房棘球绦虫ELP抗原（即EMⅡ/3，EM10抗原）。 以大肠杆菌中表达的多房棘球绦虫elp基因非融合表达产物即ELP重组蛋白作为亚单位疫苗，单独或与弗氏佐剂联合免疫BALB/c小鼠后2周（A、B组），均产生了大量的特异IgG1抗体，B组还产生了少量的特异IgG2b抗体。除B组小鼠脾PMNC产生了微量IFN-γ外，A组、NS组IFN-γ及各组IL-4和IL-12均未检出。A、B组小鼠脾淋巴细胞增殖能力轻度增高，其淋巴细胞CPM值分别为NS组的2.8和10.8倍，受到多房棘球绦虫续绦期幼虫抗原（EMML-cAg）或刀豆素刺激时, A、B组尤其是B组淋巴细胞增殖更明显。 WP=16 DNA疫苗免疫作用研究显示，首次免疫后4周Ⅱ组小鼠血清中可检测到特异性IgG1、IgG2a两种抗体，Ⅳ组可检测到特异性IgG1、IgG2a和IgG2b三种抗体。随免疫时间和免疫次数的增加特异性抗体的OD值逐渐增高。首次免疫后6周Ⅱ组和Ⅳ组均可检测到IgG1、IgG2a和IgG2b三种特异性抗体。实验结束时（即首次免疫后7w）3种特异性抗体OD值均最高。Ⅰ～Ⅳ组小鼠脾PMNC培养上清中IFN-γ浓度分别为50、55、27.5和500pg/ml，受特异抗原刺激后分别为44、101.5、28.5和500pg/
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392.1
【图文】：

ig 1-3 Results of RT-PCR with EMML RNA Extracted with different Kit图 1-3 不同方法提取的 EMML RNA 的 RT-PCR 结果同耐热DNA聚合酶对EM /3和Em10扩增效果的电泳分析见图1-4 图示Taq增产物电泳上样 3 l 可见强的单一目的条带, 高保真酶 Pyrobest 上样 10仅能看到微弱的目的条带 而高保真酶 Pfu 扩增产物 10 l 仍看不到扩增

3.4.1 测序结果与 GenBank 中相应序列的比较重组子 pEMII/3sc-11zf 中插入的目的基因编码区+463 位碱基为 T 而GenBank的EMII/3相应位置为 C 结果使编码蛋白的第 155位氨基酸密码子 CGA变成 TGA 终止密码子 其他碱基与 EMII/3 序列相同重组子 pEM10sc-11zf 插入的目的基因与 GenBank 的 EM10 相比 编码区+869位碱基分别为 G 和 A 在氨基酸水平上 第 290 位氨基酸 则分别为精氨酸CGT 和组氨酸 CAT 插入基因的终止密码子后 即插入基因的第+1697位碱基为 C 而 GenBank 中 EM10 cDNA 相应位置为 T 图 1-9CATCCCGTGGTTGGGCTCCCGTT GATTGCAGTTTACTA A A A C C A T G T T G A A G A G G A G T A A G A AT A A G A C G A A T A A G G T C A G G G T G A C T A C A G C T G A G T C A C A G TTAGAGTTTGAGATGCAGAAG G G C T C T T T G G G C C A G G A T C T C T T C G A T C A A G T G G T C C G C ACCATAGGTCTTCGTGAAGTC T G G T A C T T C G G A A T C C A G T A C A T C G A C A A A G A C G G C A A T CCAACCTTTCTAAGACTGGA

ig 2-1 Construction way of recombinant plasmid pETrx-图 2-1 重组质粒 pETrx-ELP 构建路线组质粒 pEM10sc-11zf 和原核表达质粒 pET32a(+)养基培养含 pEM10sc-11zf 的 TOP10 大肠杆菌和含 pE 以小量质粒快速抽提纯化试剂盒分别纯化 pEM10sc原核表达质粒 见第一章 2.3.3.3 1%琼脂糖凝胶电泳章2.3.3.4 pEM10sc-11zf和pET32a(+)浓度约为100酶切的基础上 设置下列酶切反应体系pEM10sc-11zf pET32a(+)

【引证文献】

相关博士学位论文 前1条

1 邵美丽;猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗的研究[D];东北农业大学;2006年

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1 王勇;猪传染性胸膜肺炎重组亚单位菌苗研究[D];东北农业大学;2007年

本文编号：2762255