利用分子育种技术构建并优化筛选抗恶性疟原虫多表位人工抗原DNA疫苗

发布时间：2020-07-19 14:51

【摘要】： 疟疾是一种在全球范围内严重影响人类健康的传染性疾病。因疟原虫和虫媒对化学药物及杀虫剂的耐药性及抗药性不断增加，全球每年有3~5亿人感染，近250万人死亡。导致目前状况的主要病原体是恶性疟原虫。由于其生活周期复杂，抗原具有阶段特异性、虫株差异性和高度变异性等特点，长期以来形成研制抗疟原虫疫苗的技术瓶颈。因此，针对恶性疟原虫不同生活时期的免疫反应特点，选取诱导产生多种免疫反应类型的不同抗原构建多表位疫苗已经成为研究抗疟疫苗的热点。但是，目前对多抗原表位疫苗的研究仍然是以人工合成多表位肽疫苗或单一固定的串联多表位DNA疫苗为主，前者成本昂贵，后者免疫原性低，难以达到预期的免疫反应多样性和令人满意的保护效果。为了解决多表位DNA疫苗的不足之处，我们首次借鉴了分子育种技术(即DNA改组)的随机重组原理，将其应用到构建多表位DNA疫苗中，建立了一套优化多表位人工抗原DNA疫苗的新方法——表位改组(Epitope shuffling)技术。 在本研究中，针对参与抗疟原虫红内期感染的免疫反应类型，我们选择了14个主要来自恶性疟原虫红细胞内期的B细胞和Th细胞表位作为研究对象。在摸索表位改组方法的过程中，先后提出并试用了聚合酶链式反应组装技术和同尾酶随机重组技术，最终以同尾酶随机重组技术构建了五个不同基因大小的多表位基因抗原库(依小到大命名为L1、L2、L3、L4和L5)。经聚合酶联式反应-单链构象多态性分析，表明了所构建的每个基因抗原库均具有较高的多表位基因随机组装多态性。通过抗原文库免疫方法，表明了不同多表位基因链长度大小的抗原文库产生了不同程度的免疫反应效果。其中以2.0kb分子量的L4和1.2kb分子量的L3多表位抗原库在免疫动物后获得了最好的免疫反应水平，并在随后用鼠疟动物模型进行感染攻击时显示出交叉保护效果。从而证实了不同多表位人工抗原基因链的长度对疫苗免疫原性具有重要的影响。同时，也证明了所构建的多表位抗原库免疫具有较理想的免疫反应效果，适合从中筛选最佳嵌合的多表位基因。 以抗原库免疫抗血清的有限稀释抗体为检测探针，通过高通量免疫化学筛选方案，分别从L3和L4的原核表达文库中筛选到三个高免疫源性基因ES312、ES391和ES452。体内免疫实验结果表明了，在相同基因表达水平的情况下，三个多表位基因的抗体反应水平较基因大小相近的其他多表位基因高出100-200倍；而酶联免疫吸附和免疫共沉淀实验证实了其产生的特异抗体具有较高多样性。在诱发产生CD4细胞水平上，三个多表位基因亦均表现出较高的免疫诱导能力。在鼠疟动物模型实验中，其中多表位基因ES312免疫可获得100％的交叉保护效果；在对恶性疟原虫的体外生长抑制实验中，细胞流式方法检测基因ES312的抑制率可高达95.8％。基因序列分析结果进一步表明了，三个高免疫原性基因在表位间组装方式，及其编码蛋白的二级结构上均具有一定的共有保守结构。这充分说明了多表位基因间的组装方式和全蛋白空间结构决定了多表位基因疫苗的免疫原性。 通过多表位人工抗原基因的体内免疫实验，我们证实其中一种人工抗原—ES312—的多表位基因串联形式能够在机体中诱导产生较强的特异性抗体反应，与此同时，在初次免疫后还诱导出以细胞因子IFN-γ为主的Th1细胞反应，在随后的加强免疫过程中又逐渐诱导出一定水平的Th2细胞反应。最终证实，只有产生这种免疫反应类型的小鼠才能有效地抵抗约氏疟原虫的攻击。通过短暂封闭ES312基因免疫小鼠的CD4或CD8淋巴细胞后再进行攻击实验，发现机体抵抗红内期疟原虫感染的能力显著增强。这些工作进一步证明，特异性CD4细胞免疫反应和体液免疫反应是抵抗红内期疟原虫感染的关键环节，而多表位人工抗原的特定表位基因串联结构对能否诱导此类免疫反应是至关重要的影响因素。 此外，为了更加准确地评价一个红内期抗原疫苗的体内外免疫保护效果，本研究对细胞流式分选方法检测疟原虫虫血率的方案进行了优化，并提出了计算疫苗对疟原虫生长抑制率的修正公式。 本研究的结果表明，我们创建的表位改组方法为构建和优化多表位人工抗原DNA疫苗提供了新的技术方向，通过大量实验数据验证了我们认为人工抗原空间构型决定疫苗免疫原性和免疫保护性的假设。这一新的多表位疫苗构建思路不仅有益于研制抗疟原虫疫苗，对其它病毒、细菌、原生动物等传染性疾病的疫苗设计均能提供有益的思路，在抗肿瘤、抗机体过敏反应和新生儿耐受等基因治疗领域也有广泛的应用潜力。
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392
【图文】：

VR1012质粒图谱

pET一30a质粒图谱

1.2单表位基因的克隆与序列分析采用两条引物间3’端匹配序列的PCR自身退火、延伸、变性、再退火的循环特点，分别大量合成每个双链表位基因(见图2)，经DNA纯化，酶切消化，再纯化浓缩后，分别与相应酶切载体VR1012连接，并转化大肠杆菌。所得转化子经载体上肋日I位点检测是否插入外源片段，和及川11确定连接方向后(见图3)，再由序列分析确定确定最终重组质粒(如图4)。图2双引物自身退火PCR扩增表位基因PAGE电泳图 Fig.2thePAGEelectr0PhoresisofePitopegenes田 rnPlifiedbyPCRonly初 thtwoPrimersI注:因编幅问题本论文仅提供部分照片，其他可见实验研究记录1

【引证文献】

相关期刊论文 前1条

1 何学虎;蔺亚晖;王恒;;恶性疟原虫多表位疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌中的表达和纯化[J];中国生物医学工程学报;2012年02期

本文编号：2762565