抗TNFα抗体的体外亲和力成熟

发布时间：2020-07-19 22:10

【摘要】：TNF α是炎症反应的一种主要介质，在许多疾病的病理过程中起着重要作用，抗TNF α抗体对这些病理过程能起拮抗作用，从而产生治疗效果。在早期工作中，我们曾从一株单克隆抗体杂交瘤克隆出抗TNF α抗体的轻、重链可变区基因并在大肠杆菌表达了其单链抗体(ScFv)和Fab抗体。为进一步提高其亲和力，本研究尝试多种突变方法，利用抗体库技术，建立体外抗体亲和力成熟流程，此流程将适用于其它工程抗体。 第一部份：随机突变提高噬菌体单链抗体的亲和力。首先对pscTNF单链抗体基因进行两轮错配PCR，构建突变库，库容为7×10~6。部份克隆测序显示碱基突变率为3.7％，氨基酸突变率为10.6％。这些突变有37％分布于CDR区，63％分布于骨架区。对此库进行四轮淘筛，获得了多株特异性结合克隆，有些结合能力有所提高，但亲和力改善不明显。为观察这些突变点重组后能否进一步提高亲和力，我们尝试了2种技术路线进行基因重组：其一，挑选了7个活性有所增强的变种克隆进行交替延伸PCR(StEP)，使这7个变种的突变位点交换重组，构建变种库，经筛选和相对亲和力测定，获得了两株(S33和S41)亲和力进一步提高的克隆。其二，利用DNA交换(DNA shuffling)的方法，对错配PCR产生的突变进行重组交换，构建次级突变库，库容为1.12×10~7，从中筛选出一株(SP21)亲和力明显提高的抗体变种。第二部份：CDR3突变提高噬菌体抗体亲和力。我们尝试了CDR3部位的限定性突变，选择Fab噬菌体抗体，采用了两种策略，一种是在合成引物时控制每个位置不同碱基的掺入比率，使亲本残基出现的几率约为70％；另一种是对选定的残基按codon-based突变合成引物，使每个残基位置有50％的随机突变，其中重链CDR3较长，前后各5个残基分别突变，通过重叠延伸PCR的方法分别构建轻、重链共6个突变库。通过四轮淘筛，经测序和非竞争性酶免分析法测定亲合常数，从轻链突变库中筛出一株(K8)变种，其亲和力提高近28倍。从重链突变库中挑出10株序列不同的特异性克隆，亲和力提高近 摘要 2一65倍。然后将突变的轻链基因与突变的重链基因组合，以及重链CDR3区前后 不同的突变点之间组合，经筛选后获得亲和力进一步提高的克隆。我们还尝试了 CDR3部位的热点突变，对单链噬菌体抗体L一CDR3和H一CDR3中的热点序列进行 随机突变，构建了库容为sxlo‘的变种库。通过4轮掏筛，得到一株(HOT68) 相对亲和指数显著提高的抗体。 本实验共尝试比较了5种突变方法。从错配PCR库中没有获得亲和力有明显 改善的抗体，在此基础上进一步通过DNA交换和交替延伸PCR使亲和力有了较 明显提高。对CDR3的突变均得到了亲和力提高的克隆，其中CDR3热点突变只获 得一株亲和力有显著提高的变种，对轻重链CDR3的限定性突变，获得了多株亲 和力提高的变种，经轻重链突变的组合后，亲和常数最高提高近93倍。总体上 分析，通过合成CDR3限定性突变引物引入突变效果最好，。 本工作得到了亲和力提高的抗TNF一a抗体，同时通过对不同突变方法的尝 试比较，初步确定了抗体体外亲和力成熟的可行方案，为以后的研究奠定了基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392
【图文】：

实验结果1致错PCR突变库的构建及筛选亲本抗本基因经过两次致错PCR扩增(图2)，构建了噬菌体突变库抗体库，其库容为7X106cfu，重组率为75%。在第四轮筛选后，随机挑取78个克隆制备噬菌体抗体进行ELISA检测，其中44个克隆0D怕。信号高于亲本抗体，8个与亲本抗体活性相当，26个低于亲本抗体。图3为部分活性较高克隆的测定结果。挑取H个ELISA检测0D值较高的克隆测序，E25为野生型

其库容为7X106cfu，重组率为75%。在第四轮筛选后，随机挑取78个克隆制备噬菌体抗体进行ELISA检测，其中44个克隆0D怕。信号高于亲本抗体，8个与亲本抗体活性相当，26个低于亲本抗体。图3为部分活性较高克隆的测定结果。挑取H个ELISA检测0D值较高的克隆测序，E25为野生型，E2与EZ一15相同，E36与E3一11相同，E42与E47相同，最终获得7个不同的突变基因序列(见表1)。其中氨基酸突变发生最少克隆是E42，共有4个残基改变(氨基酸残基按Kabat系统编号，下同。轻链可变区一个，K18一E;重链可变区3个

克隆制备噬菌体抗体，低于亲本抗体的克隆，EL工SA检测，OD值反映其中32个高于，4个相当，图6为部分活性增高克隆的检测结果。对这21个行PCR鉴定，结果均携带抗体基因。图5交替延伸PCR扩增单链抗体基因电泳图。M:DNAmarker(DL2000)A:重组的突变基因

【引证文献】

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1 王乃东;袁安文;薛立群;;链替换技术提高噬菌体抗体亲和力的研究进展[J];生物技术通报;2010年08期

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1 王乃东;鼠源性高亲和力H-Y噬菌体Fab抗体的筛选与早期胚胎性别鉴定[D];湖南农业大学;2010年

本文编号：2763035