HPV16E7抗原HLA-A2限制性CTL表位鉴定及其分子修饰的实验研究

发布时间：2020-07-21 13:01

【摘要】： 人体感染的HPV常见型别分为良性型HPV6、11型和恶性型HPV16、18型等。HPV感染后可导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤和宫颈癌等疾病，特别是恶性型HPV感染与宫颈癌的发生密切相关。HPV基因组中E区可分为8个开放读码框，分别参与DNA复制、转录、翻译、调控等，E7主要与细胞转化功能及致癌有关，因此在研究中倍受重视。目前临床上应用的干扰素等抗病毒治疗效果不确切，迫切需要寻找一种有效清除HPV感染以防止尖锐湿疣复发和宫颈癌的发生。对E7抗原的CTL表位进行预测，在国内外相关研究基础上筛选抗原性更强的表位，进行多肽的表位修饰、制备相应的治疗性肽疫苗无疑具有重要的临床意义，本课题就相关问题作了探索性研究。 E7抗原的CTL表位可以被HLA-A2、HLA-A3分子递呈，而我国HLA-A2阳性人群高达53%左右，故预测E7抗原的HLA-A2限制性表位具有重要的现实意义。本研究采用超模体方案、多项式方案与量化模体方案等对E7抗原的HLA-A2限制性CTL表位进行预测，综合考虑预测结果确定了E7_ 7-15（P1）、E7_ 11-19（P2）　、E7_ 49-57 （P3）、E7_ 66-74（P4）和E7_ 82-90 （P5）作为合成对象。对已经预测出的HLA-A2限制性CTL表位，采用标准Fmoc方案合成多肽，产物经RP-HPLC纯化、分析，并进行质谱分析鉴定。根据不同九肽疏水性的差异选择不同的流动相达到了满意的分离提纯效果，RP-HPLC纯化后，获得了纯度高于95%的九肽产物，经质谱测定分子量所得测定值与理论值相符合。高纯度的合成肽为表位筛选与鉴定奠定了前提和基础。对合成、纯化和经过质谱鉴定的多肽，运用敏感性和特异性较高的细胞毒性实验（LDH释放法）进行表位鉴定，经过特异性杀伤实验对照研究确定其特异性的抗原作用，结果发现HPV 16 E7_ 11-19（YMLDLQPET）和HPV 16 E7_ 49-57（RAHYNIVTF）属于HLA-A2限制性CTL表位。实验结果对于HPV感染治疗性肽疫苗分子设计以及临床应用试验奠定了可靠的研究基础。在前面对HPV16E7抗原表位的研究中发现，从理论上分析与HLA-A2结合力极高的P1、P4和P5，并不具备相应的抗原性。因此，为了解多肽间的相互作用关系，采 WP=9 用细胞毒实验（51Cr释放法）对T2细胞同时包被表位和另外一条多肽的方法，观察多肽是否影响表位诱导特异性CTL杀伤靶细胞。实验结果表明，HPV16E7抗原所包含的多肽序列中，P1、P4和P5与HLA-A2限制性CTL表位P2和P3之间存在明显的竞争抑制关系，其主要原因在表位本身与HLA-A2分子结合力偏低，当表位与多肽同时包被T2细胞时，其抗原诱导作用明显受到多肽的影响，因此靶细胞溶破率明显降低。多肽间的相互竞争抑制作用，可能是HPV感染局部损害反复发生、病毒难以被机体自发清除和致癌的重要原因之一，也是进行表位置换修饰的重要依据。由于HPV16E7_49-57作为HLA-A2限制性表位虽然能够诱导特异性CTL杀伤靶细胞，但与HLA-A2的结合力不高，因此本部分实验采取置换修饰的方式，以期鉴定出结合力更高又同时保留原有抗原性的新表位。对置换修饰初步得出的多肽序列运用量化模体法比较其与HLA-A2分子的结合力，选择量化积分靠前的多肽，应用计算机分子模拟的方法，从理论上了解多肽与HLA-A2的结合情况，以确定合成多肽的序列。分子模拟演示的原有表位E7_49-57与另外2条置换多肽的三维结构图和分子动力学模拟显示：各肽的羧基末端氨基酸残基侧链都指向HLA-A2.1分子肽结合槽的F凹槽；第一位氨基酸残基定位都相同，其侧链指向溶液；第二位氨基酸残基都定位于HLA-A2.1分子肽结合槽的B凹槽附近；第二位氨基酸残基的Ca和羧基末端氨基酸残基的Ca之间距离分别为P3 （E7_ 49-57）17.86 ? 、P① （RLHYNIVTF）17.86 ? 和P⑥ （RLHYNIVTV）17.72 ? 。各九肽进入HLA-A2.1分子肽结合槽后，都能被肽结合槽中部所容纳。因此，2条修饰多肽可能成为HLA-A2限制性CTL表位，可以进行多肽合成、纯化及其鉴定。分子模拟结果是进一步实验验证的重要理论基础。经过分子模拟初步证实后，根据标准Fmoc方案采用固相合成法合成多肽，经RP-HPLC纯化、纯度分析，用质谱进行定性鉴定。对经过合成、纯化和鉴定的多肽序列，运用细胞毒实验（LDH释放法）鉴定其抗原性，实验采用包含HPV16E7序列、HLA-A2+的宫颈癌细胞株作为靶细胞，对照肽、P①和P⑥诱导特异性CTL杀伤靶细胞的结果表明P①具有诱导杀伤作用，P⑥与对照肽无此作用。因此P①可初步确定为HPV16E7抗原HLA-A2限制性新的CTL表位。其置换的氨基酸位于第2位，置换成亮氨酸，置换后第二位氨基酸残基的Ca和羧基末端氨基酸残基的Ca之间距离仍然保持不变，为17.86 ?；而同时置换第2位和第9位氨基酸的多肽P⑥，第二位氨基酸残基的Ca和羧基末端氨基酸残基的Ca之间距离缩短为17.72 ?，尽管仍然符合HLA-A2分子限制性表位要求，但对包含HPV16E7序列、HLA-A2+的宫颈癌细胞株没有诱导 WP=10 杀伤作用，没能保留原有表位HPV1E7_49-57的抗原性。表位抗原性可以通过相关的体外实验和体内实验来确定。体外实验初步确定了HPV16E7_49-57及其置换修饰多肽P①的抗原性，后续实验通过荷瘤小鼠体内实验，观察2种多肽在体内能否诱导特异性CTLs杀伤靶细胞，进而影响肿瘤的生物学特性，为临床上?
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392
【图文】：

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【共引文献】