人心肌特异的新蛋白激酶p93在心脏发育、结构性心脏病中的功能与机制研究

发布时间：2020-07-22 04:43

【摘要】：心血管系统的发育、生理、病理等一系列过程主要由构成心血管系统基因组的20，900-27，160个基因控制(刘宗正教授，个人交流)。克隆与鉴定心血管系统疾病相关基因不但对我们了解心血管系统的发育及生理、病理机制具有重要意义，并可为临床心血管疾病的治疗提供基础。 伴随人类基因组计划发展起来的生物信息学给寻找、研究心血管系统的重要功能和／或疾病相关基因带来了新的契机。本研究在构建成人心脏cDNA文库并进行新ESTs(expressed sequence tags)分离的基础上，综合数据库及生物信息学分析，克隆出某些与心血管系统疾病相关的基因，并进一步进行功能鉴定。本文介绍其中两条新全长cDNA，即心肌特异的蛋白激酶p93和肌组织特异的细胞骨架调节蛋白NELIN,现将主要研究结果概述如下： 一、我们在1p31-p21的房室间隔缺损区克隆到一新的蛋白激酶基因(GenBankac．AF116826)，该基因cDNA全长约3420bp，含一个2505bp的完整阅读框，可编码835个氨基酸分子量约为93kD的蛋白质，故将其命名为p93。结构域分析表明p93含三种结构域：N端为7个锚蛋白重复(ankyrin repeats)结构域，中间为一激酶结构域，C末端为富含丝氨酸结构域。同源性分析提示p93为整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)的远源同源基因。种系发生分析发现p93与ILK等可能同属MAPKKKs家族成员。 用胎儿6种组织、成人8种组织的Northern Blot(Clontech)结果表明，p93仅只在胎儿和成人心脏表达一全长约3.42kb的转录本，而其它组织未见表达。经76种组织的多组织点阵膜(Clontech MTE)杂交也证实，p93仅在成人及胎儿的心脏表达。在成人心脏各个部位的表达有以下特点：室间膈、心尖最强，右心房及右心室次之，左心室较弱，左心房最弱，其它各种组织未见表达。说明p93确为心脏特异表达的基因。 用核酸免疫法制备了兔抗p93的多克隆抗体，其抗体效价及特异性经原核表达的蛋白进行了检测。心肌免疫组化结果显示，p93主要在成人与胎儿心肌细胞核内表达，胞浆也有少量表达，心肌内的血管平滑肌和内皮细胞呈阴性。 用重叠延伸点突变PCR法构建p93(K490R)突变体，并对真核表达的p93及其突变体进行了激酶活性体外分析。结果显示，仅野生型p93能自我磷酸化，而突变体及空载体未显示相应的磷酸化蛋白条带。 以C-端(第716-833aa)为诱饵，经酵母双杂交筛选预转化的心脏cDNA文库，结果发现p93能与下列三类蛋白发生相互作用：①属肌小节蛋白的cTnI、MyBP-C、
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R346
【图文】：

为克隆心血管系统重要功能基因，我们构建了成人心脏的DcNA文库，并在新ESTs分离基础上，结合生物信息学分析，克隆了两个可能与结构性心脏病和心脏发育有关的新基因夕刃、八乞Z，NI并对p93进行了功能鉴定。图1是本文的研究策略。

.1.重组腺病毒制备、纯化利用pAdEasy系统产生重组腺病毒技术线路见图3〔44]:9.1.1将目的基因p93克隆入pAdEasy转移载体.考虑到将来细胞功能实验时，为使p93蛋白的表达最高，设计引物，使读码框的第一个起始密码AGT周围序列为丛卫AT巡，符合Kozak序列:即一3位是A，+4位是G。以PcNDA4一p93为模板，用高保真的puf酶将基因的整个读码框亚克隆入pUC18，序列经测序准确无误后，再用人》刀工和Hz’nd工H双酶切将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTraek一CMV。PCR扩增条件如下:94Co4min:94℃455，55Colmin

所以本研究所克隆的p93的第四外显子应该还缺3obp。基于①②考虑，即p93的5’UTR还缺约36Obp，恰好相当于三个外显子长度，所以p93应该有28个外显子。p93的定位见图5。2)转录起始位点、启动子区及上游调控序列在p93上游确实发现了负责调控心脏特异基因表达的转录因子GATA结合位点闹。然而由于生物体有一套基于外显子(而非内含子)的剪切机制，以至于外显子的长度即使在不同种属间(例如线虫和果蝇)也比较保守，但内含子的长度变异较大。而且由于真核生物的基因，其调控序列跨度较大，所以p93真正的起始位点及其启动子区比较难以估计。所以研究刀刃转录调控机制还有待实验的进一步研究。

【共引文献】

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本文编号：2765341