基于P颗粒的诺如病毒GII.4型流行株进化机制及免疫保护研究

发布时间：2020-07-24 09:45

【摘要】：诺如病毒(NoVs)是世界范围内流行性急性胃肠炎的最主要病原体之一。无论发达国家还是发展中国家,各个年龄段中NoV都有很高的感染率。美国疾病控制中心(CDC)估计,仅美国每年有至少2300万例NoV导致的病毒性胃肠炎病例,每年因NoV胃肠炎导致直接治疗费用和间接所致的经济损失达数亿美元。 由于缺乏细胞培养系统,亦无合适的动物感染模型,一直以来NoV发病机制研究进展缓慢。目前尚缺乏针对NoV胃肠炎的有效疫苗及抗病毒药物。近年来,随着国外学者对NoV基因组结构和衣壳蛋白研究的日益深入,24聚体的P颗粒成为该领域的研究创造了物质基础和新的研究思路。利用P区域蛋白(P颗粒)与生物合成的人类组织血型抗原(HBGA)受体抗原(A型/B型三糖)进行共结晶的晶体学结构研究,结果表明其受体结合位点位于P2亚区,即P区域的最外端。P颗粒具有与VLPs相似的立体空间结构,及天然结合宿主HBGA受体特性和高免疫原性,提示P颗粒可用于探索NoV受体结合及疫苗研制的理想模型。 本研究在开展了1974-2012年间流行的NoV优势株GⅡ.4型毒株的基因遗传分析基础上,以表达的P颗粒为主要研究对象,进行了不同时期GⅡ.4型毒株P颗粒与HBGAs受体的结合方式和不同毒株的抗原关联性研究。旨在讨论宿主受体因素及宿主免疫因素在GⅡ.4的进化中所起的作用,为制定NoV疫苗策略提供依据。同时研究了抗P颗粒单价及抗P-VP8*嵌合P颗粒双价IgY抗体在NoV及轮状病毒(RV)感染中的被动免疫保护作用。 (一)HBGAs受体选择在GⅡ.4型NoV流行进化中的分子机制研究 NoV的遗传基因和抗原性呈高度多样性,根据病毒RNA聚合酶编码区核苷酸或外壳蛋白区氨基酸序列的差异可将NoV分成5个基因组。其中GⅠ、GⅡ、GⅣV基因组主要感染人类,GⅡ、GⅢ、GⅣ和GV组可分别感染猪、牛、犬及鼠。GⅠ、GⅡ又可以进一步细分为至少8和21个基因型,每个基因型包括多个变异毒株。自上世纪90年代中期开始,GⅡ.4基因型持续高流行。仅此一个基因型别就占了NoV世界范围内流行的60%以上,且每隔1-3年便产生新的变种,据此,有学者提出宿主免疫选择可能是导致NoV不断进化的因素之一。 然而,我们团队通过前期研究提出HBGA受体对GⅡ.4型NoV分子进化的强选择是其分子进化的重要机制的假说：即在宿主变异的推动下,病毒的抗原性持续的改变；同时HBGAs作为趋同因素,通过对病毒结构的限制起到功能性的选择作用,即HBGA受体选择在GⅡ.4NoV分子进化中亦发挥着重要作用。 为了进一步阐明并验证该假说,本研究对1974-2012年间流行的82株GIⅡ.4型病毒株进行了遗传分析,HBGA受体结合域氨基酸保守性分析显示该区域氨基酸高度保守：S343(100%,即82株第343个氨基酸100%为S),T344(100%),R345(100%), D374(100%), S441(100%), G442(98.8%)和Y443(100%),结果表明NoV表面的HBGA受体结合区域高度保守。基于目前可获得的NoV晶体结构基础上进行序列深入分析,发现GⅡ.4NoV的HBGA受体结合界面形成了高度保守的口袋样受体结合域并能与HBGA抗原的重要位点结合。口袋样受体结合域周围则存在相对具有变异性的结构,该变异性结构主要负责与HBGA抗原的另外一个寡糖结合。 利用大肠杆菌表达系统表达2000-2012年间加拿大阿尔伯特地区流行的10株GⅡ.4型NoV P颗粒(其中6株为新现的2008b和2010基因簇),通过唾液HBGA结合鉴定及人造寡聚糖(生物合成)HBGA结合鉴定实验表明：虽然不同株别的P颗粒结合A、B、H抗原的亲和力存在不同程度的差异,但所有10株GⅡ.4NoV均能结合分泌型HBGA。由于分泌型人群占到总人群的80%-85%,GⅡ.4的高流行与其与HBGA的结合谱相一致,说明GⅡ.4高流行正是在HBGA的选择下NoV长期进化的结果。 在此基础上,我们利用GⅡ.4志愿者攻毒试验获得的配对血清开展了血清学抗原性分析,研究发现1998-2012年间14个变异株之间存在显著的交叉抗原性,通过HBGA受体阻断实验(NoV体外中和实验替代模型)亦发现志愿者血清对不同毒株具有交叉阻断能力,提示GⅡ.4感染产生的抗体对不同变异株存在交叉保护作用。 研究结果为GⅡ.4型NoV分子进化机制及疫苗研制策略提供了进一步的实验数据和理论基础。即：①高度保守的口袋样受体结合域为宿主HBGA受体因素强选择的结果,这将为研制抗GⅡ.4NoV疫苗提供重要依据；②序列中变异区域为HBGA和宿主免疫共选择的结果。同时由于GⅡ基因组NoV的HBGA口袋样受体结合域亦相对保守,进一步深入研究GⅡ NoV抗原交叉反应性将为下一步研制更为广谱的NoV疫苗提供依据。 (二)抗NoV P颗粒单价IgY抗体的制备及其HBGA受体阻断作用 被动免疫是预防和治疗感染性疾病的有效策略。利用哺乳动物血清中提取的抗体进行口服治疗的研究已有报道。但是,由于在哺乳动物中进行大规模生产抗体的花费高,使得其应用一直受到限制。与多克隆抗体相比,用单克隆抗体进行被动免疫所产生的保护水平也较低。鸡IgY由于其生产成本低、产量而成为是被动保护抗体的一种有效选择。近几年,多个研究表明鸡IgY对粘膜病原体,特别是病原体引起的肠道内感染非常有效。 本研究采用NoVs P颗粒蛋白免疫来航鸡,制备了NoV特异性IgY抗体。结果显示：鸡蛋蛋黄中自第3周开始产生特异性抗体,到第7周抗体滴度达到最高并一直持续到第16周,抗体滴度达到200,000-500,000,平均每个鸡蛋中NoVs特异性抗体含量高达4.7-9.2mg。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹(Western blot)实验表明从蛋黄中分离的IgY抗体与NoVs P颗粒有很强的免疫反应,并且能阻断NoVs病毒样颗粒(VLPs)及P颗粒与HBGA受体结合(NoV体外中和实验替代模型),BT50为1：800。鸡IgY在70℃温育30分钟或者在pH4-9的环境中处理3小时后仍能保持80%以上的HBGA受体阻断活性。NoVs IgY抗体滴度高、产量高,具有在胃肠道中稳定性好、成本低廉等特点,为抗NoV感染的被动免疫治疗提供了潜在的应用前景。 (三)抗P-VP8*嵌合P颗粒IgY抗体的制备及其对NoV/RV的双价免疫保护作用 轮状病毒(RVs)和NoVs是导致病毒性腹泻最主要的两种病原体。RVs每年在世界范围内引起1.385亿婴幼儿严重腹泻,包括造成2500万的就诊量,超过200万的住院量和453,000五岁以下儿童死亡。RVs和NoVs在儿童和/或老年人中引起严重的疾病,并在免疫受损的病人中造成持续性感染。因此,被动免疫策略来控制和预防临床RVs和NoVs的感染是有必要的。 本研究利用P-VP8*嵌合P颗粒蛋白免疫来航鸡,成功大规模制备了抗人类NoVs和RVs的双价特异性IgY抗体。在首次免疫后第二周的血清和第四周的蛋黄中就检测到P-VP8*抗体,特异性抗NoV抗体滴度与单独用NoV P颗粒免疫获得的抗体滴度相似(750,000-800,0000),而其抗RV VP8*抗体滴度(～80,000)显著性高于单独用VP8*抗原免疫获得的滴度(～48,000)。Western blot分析结果表明抗P-VP8*IgY与NoV VLP和RV VP8*具有特异性反应。HBGA受体阻断实验表明：抗P-VP8*IgY具有阻断NoV与HBGA受体A、B抗原的结合能力(BT50为1：1,200-1：1,300)；同时具有阻断RV与HBGA Leb (BT50为1：80)及H-1抗原(BT50为1：240)的结合能力。RV体外中和蚀斑实验及免疫荧光实验显示抗P-VP8*IgY可阻断Wa毒株的体外复制(IC50为0.304mg/ml)。利用CPE及Western blot分析,发现抗P-VP8*IgY对体外RV病毒接种前(预防)、接种后(治疗)复制具有抑制作用。研究结果表明P-VP8*诱导的IgY具有开发出一种同时有效预防和治疗NoV和RV感染的免疫制剂的应用前景。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373

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本文编号：2768661