流感病毒为载体的重组FLU-RSV疫苗株构建及免疫保护效果研究

发布时间：2020-07-24 12:11

【摘要】：研究背景呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而流感病毒（Influenza virus，FLU）和呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）则是重要的呼吸道病原体。目前，流感已有安全有效的不同类型疫苗，为流感的防控提供了保证。而RSV由于自身免疫特性，至今没有批准使用的疫苗，为其防控提出了挑战。RSV是婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和肺炎死亡的重要原因。据统计，6个月以内的婴幼儿因RSV感染导致住院达70%，2周岁以内的儿童甚至高达99%。RSV因其致病范围广，病情高发，且会引起严重的并发症等，给人类健康和生命安全造成了严重威胁。 RSV属副粘病毒科肺病毒属的非节段性单股负链RNA病毒，含A、 B两个血清型。RSV基因组全长约15Kb，编码10种主要蛋白，分别由三个跨膜蛋白（G、F和SH）、两个基质蛋白（M和M2）、三个核衣壳蛋白（N、P和L）及两个非结构蛋白（NS1和NS2）构成，其中融合蛋白F（Fusion protein，F）和附着蛋白G（Attchment protein，G）是RSV激发机体产生保护性抗体最重要的病毒蛋白。G蛋白易变异，并非感染和细胞融合所必须的；F蛋白能够稳定遗传，单独的F蛋白就可引起细胞融合病变。针对RSV F和G糖蛋白的全身性中和抗体能有效防止RSV再感染，因此RSV F和G蛋白已作为公认的保护性抗原和毒力致病分子。疫苗是控制传染病最有效的手段之一。对于RSV而言，20世纪60年代，Fulginiti VA等研制的福尔马林灭活疫苗（FI-RSV）由于诱发Th2型免疫过激导致2名儿童死亡和80%住院以失败告终。目前RSV疫苗的研究主要集中在载体疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗，已有多种疫苗类型正在研制，但至今无获批的RSV疫苗可用。RSV疫苗的研究一直是国际社会关注的焦点，从已有的研制中的RSV疫苗可见，注射免疫不能产生有效的粘膜和细胞免疫反应且免疫保护效果受限、DNA疫苗存在潜在安全性以及全长F、G蛋白疫苗存在潜在Th1/Th2失平衡等瓶颈问题亟待解决。近年来，随着流感病毒反向遗传学技术日亦成熟及流感病毒载体的自身优势，以流感病毒作为递送系统成功研发的RSV疫苗候选株能够产生双重免疫保护效果，且安全性高、易于操作，具有广阔的发展前景，有望为RSV疫苗研究提供新的思路。研究目的采用流感病毒反向遗传学技术重配筛选出流感病毒为载体的重组FLU-RSV疫苗株；对重组FLU-RSV疫苗进行全面的鉴定，进而免疫动物和攻毒，评价重组FLU-RSV疫苗的免疫原性和免疫保护性，为发展RSV疫苗和实现“一苗两用”提供思路和实验依据。方法和结果第一部分流感病毒为载体的重组FLU-RSV疫苗株的构建及鉴定首先，采用免疫抗原生物信息学预测和文献调研，筛选并确定RSV F保护性抗原表位F205-223（PIVNKQSCRI SNIETVIEF）和F255-278（SELLSLINDMPITNDQKK LMSNNV），以及G保护性抗原表位G142-204（QPSKPTTKQRQNKPPNKPNN DFHFEVFNFV PCSICSNNPT CWAICKRIPN KKPGKKTTTKPTK）。F保护性抗原表位使用GPG Linker连接，并将F205-223-GPG-F255-278命名为F， G142-204命名为G。将RSV抗原表位F、G和F+G分别插入到流感病毒非结构蛋白NS1基因片段中，基因NS1-F、NS1-G和NS1-F+G分别与双向转录表达载体pHW2000通过BSmBⅠ酶切、切胶回收、目的质粒与pHW2000载体连接、转化DH5α感受态及菌液PCR等构建重组质粒。当琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物发现阳性条带、菌液送生工测序与预期序列吻合，表明重组质粒NS1-F、NS1-G和NS1-F+G构建成功。重组质粒NS1-F、NS1-G和NS1-F+G分别与已构建的流感病毒7质粒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M通过“7+1”组合，采用Effectene将流感病毒8质粒共转染COS-1/MDCK细胞，其中以重组质粒代替NS质粒进行转染；24h后将6孔板中的培养基换成0.8μg/mL TPCK胰酶的无血清DMEM培养液；48h后吸取上清进行血凝初检。当发现血凝阳性结果，将该孔的细胞及上清接种9日龄SPF鸡胚。3天后吸取尿囊液，进行血凝复检，结果显示阳性。重组FLU-RSV疫苗病毒液接种鸡胚，连传3代能稳定遗传，表明重组FLU-RSV疫苗株重配成功，我们将其分别命名为rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G。重配成功的重组FLU-RSV疫苗病毒株经接种鸡胚扩增、30KD超滤膜包浓缩、30%-60%蔗糖密度梯度纯化，测定其血凝效价和CCID50病毒滴度。Westernblot检测成功表达RSV特异性的蛋白，电镜观察发现重组FLU-RSV疫苗病毒株的大小分布及粒子结构符合流感病毒的形态特征，细胞培养显示重组FLU-RSV病毒可在MDCK、 A549和CNE-2Z细胞有效复制。以上结果表明，成功重配了流感病毒为载体的重组FLU-RSV疫苗株。第二部分流感病毒为载体的重组FLU-RSV疫苗免疫原性和免疫保护效果评价选用6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为7组，每组30只。采用上述成功重配的rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株为实验组，同时设立104CCID50和105CCID50两个剂量组，并用0.01M PBS为对照组。小鼠按上述剂量进行滴鼻免疫，20μL/只。0天、28天免疫，共2次。免疫前、初免后4周和二免（加强免疫）后2周收集小鼠血清、肺鼻灌洗液及脾淋巴细胞悬液。取免疫小鼠血清测定针对流感病毒和RSV的中和抗体效价和针对RSV的IgG类抗体及亚型IgG1和IgG2a的滴度，用于评价重组FLU-RSV疫苗株的免疫原性；取小鼠脾淋巴细胞悬液测定针对RSV的细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ和TNF-α，用于评价Th1/Th2系统免疫应答平衡；取小鼠肺鼻灌洗液测定RSV特异性的抗体sIgA效价，用于评价重组FLU-RSV疫苗株的粘膜免疫应答。实验结果表明，rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株在小鼠体内能够产生针对流感病毒和RSV的中和抗体，产生针对RSV的Th1型细胞免疫反应及粘膜免疫反应，且Th1/Th2免疫应答平衡，而PBS对照组阴性。同时，rFLU/RSV/F+G疫苗株的免疫原性优于rFLU/RSV/F和rFLU/RSV/G。由此初步推断，rFLU/RSV/F+G疫苗株是最有潜力的RSV候选疫苗株。采用加强免疫2周后的各组小鼠，每组20只，分别用当前流行病毒株，即PR8流感病毒野生株（100LD50）和RSV A2株（2×106PFU/mL）对小鼠进行滴鼻攻毒，连续2周记录小鼠病毒攻击后的体重变化及存活情况。PR8流感病毒攻毒第四天测定小鼠肺和鼻甲骨组织的病毒载量，HE染色观察肺病理变化；RSV A2株攻毒第六天测定小鼠肺和鼻甲骨组织的病毒载量，HE染色观察肺病理变化，并计数小鼠支气管肺泡灌洗液中的炎性细胞总量及各个炎性细胞数量，主要包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、小单核细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞。攻毒结果显示，rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株能对免疫小鼠产生有效的免疫保护效果，且免疫保护效率提示rFLU/RSV/F+G＞rFLU/RSV/F＞rFLU/RSV/G，进一步表明rFLU/RSV/F+G疫苗株具有显著地免疫原性和免疫保护效果，能有效提高机体的体液、细胞及粘膜免疫应答，是最有潜力的流感病毒为载体的RSV疫苗候选株。结论通过反向遗传学技术成功重配筛选出以流感病毒为载体的重组FLU-RSV疫苗株。鉴定结果显示rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株可在MDCK、A549和CNE-2Z细胞有效复制、重组病毒形态与流感病毒相符且表达RSV特异性的保护性抗原蛋白。免疫原性评价结果显示，重组FLU-RSV疫苗在小鼠体内能够产生针对流感病毒和RSV的中和抗体，产生针对RSV的Th1型细胞免疫反应及粘膜免疫反应。攻毒结果表明，重组FLU-RSV疫苗株对免疫小鼠具有显著的免疫保护效果，可以同时抵抗流感病毒和RSV的感染，且rFLU/RSV/F+G疫苗株突显更大的优势。以上研究为发展RSV新型疫苗及实现“一苗两用”提供了实验依据。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.13;R392
【图文】：

全序列,克隆载体

克隆载体pHW2000的全序列

克隆载体,体积

图 2 克隆载体 pHW2000Fig.2 The cloning vector pHW2000合成的重组质粒 NS1-F、NS1-G 和 NS1-F+G 及实体进行酶切，酶切体系如下：酶切反应体系体积（μL）组成体积（μL）组成体积（μL）组成1.5 BSmBⅠ 1.5 BSmBⅠ 1.5 BSmB4 Buffer 3 4 Buffer 3 4 Buffe34.5 NS1-G 34.5 NS1-F+G 34.5 pHW20

重组质粒,全序列

重组质粒NS1-F全序列

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