人源KGF-2基因的克

发布时间：2020-07-25 17:49

【摘要】：皮肤是人机体最重要免疫器官之一，其损伤的修复是一个非常复杂的过程,由多种生长因子及细胞因子介导。人纤维细胞生长因子（FGF）超家族是参与结缔组织生长、皮肤愈合的主要因子，人角质细胞因子-2（KGF-2）是该超家族成员之一。KGF-2对多种因素如急慢性炎症、溃疡、物理化学烧伤等引起的组织器官损伤的修复过程发挥重要作用，并且在整个脊椎动物的胚胎发育过程中起着不可替代的作用，参与并调控多种组织和器官的形成和分化。因此KGF-2有着很好的应用前景，在临床上可以用于治疗多种表皮损伤相关疾病。 本文的主要研究内容为成功构建了KGF-2重组高效表达载体；通过初步发酵条件优化，获得了稳定高表达的工程菌株；经过纯化工艺摸索及优化，得到稳定简便且获得高纯度蛋白的纯化工艺，具有极大的应用价值。纯化后的蛋白经过活性检测，具有一定的生物学活性，为以后的科研应用打下了坚实的基础。主要研究结果如下： 1.通过优化密码子，成功构建了pET-30a(+)-hKGF2重组表达载体，通过表达条件的优化获得高效、可溶性表达的KGF-2重组蛋白。 2.通过确定培养基配方、诱导温度、诱导时间、诱导pH等发酵主要条件进行工艺参数优化，在此基础上进一步确立了高密度发酵条件。 3.建立了适合放大的纯化工艺路线，确立了简便快捷可线性放大的纯化工艺，通过高压破菌、Heparin亲和层析、超滤脱盐及DEAE阴离子层析方法，得到了高纯度的目标蛋白。 4. rhKGF-2对体外培养角质形成细胞的生长有非常显著的促进作用,在3D气液培养体系中亦可促进组织工程皮肤表皮中角质形成细胞的生长及分化。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【图文】：

-20℃冰箱中保存[41][42]。性核酸内切酶酶切技术ppendorf 管中，依次加入重组质粒 DNA10μg、.5ul，NdeI 1.5ul，补水至 20ul，使体系尽量混匀切完全。反应结束时，每管可加入 2μl 100mmol/L。酶切结束后，取少量进行琼脂糖凝胶电泳检测 测序及限制性酶切图谱的构建 双脱氧中止法进行双链 DNA 的核苷酸序列测定。由核苷酸序列推导出的氨基酸序列比较，采用STAL X(1.8)等进行。通过 DNASSIST 2.0 构建目

图 1-2 pET30a(+)-KGF-2 物 图谱图 1-3 表达质粒限制性内切酶酶切鉴定图谱1. Marker 2. 质粒 3. PstI 酶切 4. NdeI/ SalI 双酶切

11 1-3 表达质粒限制性内切酶酶切鉴定图arker 2. 质粒 3. PstI 酶切 4. NdeI/ SalI 双系统主要有真核表达体系和原核表达体细胞表达体系、昆虫细胞表达体系和酵杆菌表达体系和枯草芽孢杆菌表达体系晰、易操作、繁殖快、高表达及成本低达体系也有易形成包涵体、重组蛋白不KGF-2 是不需糖基化也可表现出良好的生

【参考文献】

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1 王晓杰;周鑫;田海山;马吉胜;焦悦;张睿;蔡敏倩;钱焕文;李校X;;重组人角质细胞生长因子-2对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用[J];吉林大学学报(医学版);2010年04期

本文编号：2770163