Cbfa1基因修饰间充质干细胞治疗骨缺损的实验研究

发布时间：2020-07-30 07:39

【摘要】：骨缺损(bone defect)、尤其是长段骨缺损一直是骨科界的难题之一。迄今为止临床上对因创伤、感染和肿瘤切除后所造成的长段骨缺损的修复仍未得到有效的解决。传统的移植方式主要有自体骨移植和异体骨移植，但自体骨移植面临着骨源受限、增加创伤和感染率等缺陷，而异体骨移植存在生物活性差、免疫排斥反应和传播疾病的危险。上世纪九十年代开始，研究者将更多的注意力放在了组织工程骨的开发和研究上。其基本方法是将体外培养的种子细胞种植在具有生物相容性和可降解性的天然或者人工合成的细胞外基质上，然后将此细胞．支架材料复合物植到体内，以诱发所希望的细胞响应(粘附、分化和增殖等)。目前，骨组织工程的研究主要集中于种子细胞的研究、支架材料的研制和组织工程化人工骨对骨缺损的修复。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有自我更新和复制能力的成体干细胞，具有明确的成骨分化潜能，易于获得及扩增，其独特的细胞增殖分裂模式使外源基因易于导入和表达，因此成为目前研究最广泛的组织工程骨种子细胞。与骨膜源成骨细胞等其它种子细胞相比，MSCs具有取材方便、对供体部位损伤小等优点，临床应用前景更广阔。MSCs在条件培养基的诱导下可以体外分化为成骨细胞，尽管已有实验证实，多种生长因子如骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、成骨因子1(osteogenic protein-1，OP-1)等能促进MSCs的成骨分化，然而如何使MSCs进行定向诱导成骨分化，从而更好的应用于骨组织工程是我们亟待解决的问题。 Cbfal是成骨细胞特异性转录因子，成体中仅在成骨细胞和骨组织表达；胚胎发育过程中，Cbfal在间充质细胞凝聚区高表达。基因敲除鼠证明Cbfal对成骨细胞分化和骨形成具有重要作用。利用Cbfal对MSCs进行基因修饰，是否可以达到定向成骨诱导分化的效应?本实验围绕这一中心展开研究。本实验在成功构建Cbfal重组腺病毒和分离培养纯化MSCs的基础上，检测了Cbfal对MSCs的成骨定向分化作用，并利用改良设计的流动腔灌流装置，对Cbfal基因修饰MSCs与脱细胞骨基质复合后动态培养，观察了所构建的组织工程化骨对兔桡骨大段骨缺损的修复效应，并对其机理进行了初步探讨，其主要结果如下：第三军医大学博士学位论文 1.首先利用基因同源重组原理，通过pAdEasy腺病毒系统构建了Cbfal重组腺病毒，以及对照病毒pAdEasy一GFP一gal。并通过GFP荧光表达、PCR等方法证明目的基因存在于所构建载体中。病毒纯化后病毒滴度达1.6x 10’2，NIH3T3细胞感染实验显示，Cbfal腺病毒能有效的介导Cbfal的表达。 2.利用Cbfal重组腺病毒转染MSCs，经蛋白印迹、免疫组化、荧光观察等证实了Cbfal目的基因在MSCs中的表达。同时利用RT一PCR、对硝基苯磷酸二钠法和放免法检测成骨细胞标志基因ALP、OCN、OPN、I型胶原表达及BMP一2、MyoD、PPAR YZ、OPG等基因表达，结果Cbfal可以提高除I型胶原外大部分成骨细胞标志基因的表达，ALP活性和OCN含量明显提高，而成脂、成肌方向分化明显抑制，骨矿化小结计数明显增多，表明Cbfal基因修饰可以促进MSCs的成骨定向分化。 3.对云南版纳小型猪近交系的骨组织进行脱细胞处理，获得脱细胞骨基质材料，经组织学染色、SEM观察、异种抗原检测和生物力学检测表明该基质材料在去除细胞成分的基础上，消除了抗原性，保留骨细胞外基质的生理结构，为种子细胞的种植提供了良好的空间结构和生长环境。细胞种植在该材料上后，细胞的增殖和生长不受抑制，可以正常的粘附、伸展及分化。因此本实验制备的脱细胞骨基质具有良好的细胞相容性、骨诱导性和力学特性，是一种较理想的支架材料。 4.改良设计一种新型的流动腔灌流体系，实现种子细胞的动态种植和体外培养。检测培养7d后ALP活性和OCN含量，显示流动腔组明显高于静态培养组，而Cbfal 组明显高于对应的对照组。表明Cbfal作为流体力学刺激的靶基因，进一步促进了 MSCs的定向分化:也证明了我们改良设计的流动腔灌流装置是一种简便易控、有效的生物反应器。 5.建立兔挠骨1.2cm骨缺损，分别以材料一Cbfal基因修饰细胞、材料一未修饰细胞、单纯材料和不作处理的空白对照进行修复实验，在4w、sw、12w进行X线检查和组织学观察。结果表明空白组骨不连，单纯材料组有少量新骨生成，材料一未修饰细胞组有较多新骨生成，材料一基因修饰细胞组在12w得到了临床治愈。总之，本实验成功地构建了Cbfal重组腺病毒，并利用其转染MSCs，使MSCs 在Cbfal的调控下成骨定向分化;制备了版纳小型猪的脱细胞骨基质，以此为支架材料，对Cbfal基因修饰的MSCs进行动态培养，明显促进了细胞的成骨分化;并观察了所构建的组织工程化骨对骨缺损的修复作用，旨在为骨缺损的治疗提供新的思路，为干细胞组织工程的研究奠定实验基础。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329

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