人源抗肝癌抗体Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

发布时间：2020-07-31 14:01

【摘要】：噬菌体抗体库技术为人抗体的制备提供了强有力的手段，是近年来抗体技术中的革命性进展。我们用经肝癌细胞体外免疫的淋巴细胞构建了表面表达Fab的人源性噬菌体抗体库，并筛选出两个特异性与肝癌细胞结合而不与正常肝细胞结合的Fab噬菌体克隆。 淋巴细胞的分离和体外培养 淋巴细胞来源于13例原发性肝癌病人外周血单个核细胞和一例肝癌病人的肿瘤引流区淋巴结。分离得到的淋巴细胞在体外进行培养，培养液中含有IL-2，PWM和LPS。肝癌细胞系SMMC-7721用细胞固定液固定或经。~(60)Co照射后，加入淋巴细胞培养液中，进行体外免疫。培养7天后出现胞体增大的淋巴母细胞并可见克隆性增生。 人Fab抗体库的构建 从体外培养的淋巴细胞中提取总RNA，并用一套引物逆转录PCR扩增出7种Fd基因(γ)和9种全长轻链基因(6λ，3κ)。通过将轻链基因和重链Fd基因插入噬菌体表达载体pComb3并经辅助噬菌体VCSM13超感染，构建了人Fab组合抗体库。用羊抗人IgG Fab和HRP-羊抗人IgG Fab进行夹心ELISA检测，可以鉴定噬菌体表达Fab的情况。 抗体库的筛选 将抗体库与肝癌细胞系SMMC-7721孵育，结合的噬菌体用Ph2.2的洗脱缓冲液洗脱，并感染XL1-Blu进行增殖。为了提高肝癌特异性结合的噬菌体并降低无关噬菌体的结合，我们采用了竞争筛选方法。首先将抗体库与肝癌细胞结合，然后稀释到过量的正常肝细胞悬液中，
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：1999
【分类号】：R735.7;R392
【图文】：

巾拳二壬二巴学忿毛立示仑用淋巴结来源的CDNA为模板，上述基因中有的没Fd基因中，扩增出vHlf，vHZ一4f，vHla，VH3a;Fd基因用混合的上游引物扩增出弱阳性;基因中扩增出VLZ，VL3，VL4，VLS，VK抓。7依次为:VHlf，VHZ一4fM:f，(’RMa丈、ker(237，377VH3f，VH6f，VHla，VH:〕a，515，697，994，154:弓)

依次为:VHlf，VHZ一4f:f，(’RMa丈、ker(237，377VH3f，VH6f，VHla，VH:515，697，994，154:弓)图3PC尺扩增人工g(1i轻链基因依次为:vLI，vLZ，vL3，vL4，vLS，vL6，M:Pc

图8单个噬菌体克隆与肝癌细胞结合活性的EL工AS结果(F7和HI为PBS阴性对照)正常肝细胞结合ELIAS将上述阳性克隆中D0值较高的37个克隆，进行正常肝检测，同时做肝癌细胞结合ELIAS作为平行对照。结果:肝癌细胞和正常肝细胞两者都结合，只有6个克隆不合。这些克隆分别是:A6(32)，Bzo(69)，el(70)，eZ(CS(83)。图9单个噬菌体克隆与肝癌细胞结合活性的ELIAS结果(DS一10为PBS阴性对照)

【引证文献】

相关期刊论文 前1条

1 柳鹏程;乔涵;刘斐斐;刘毕胜;吴倩妮;张燕燕;单金玉;魏莲花;马兴铭;;噬菌体作为模式生物在蛋白表达和病毒学方面的应用[J];中国微生态学杂志;2012年05期

本文编号：2776563