HBV感染抗原表位特异性CTL的研究

发布时间：2020-07-31 15:23

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染仍为全球重要健康问题之一,大约有3亿5千万慢性感染人口,每年死于HBV感染的人数达1百万。我国HBV感染人群比例更大,估计占总人口的10%。HBV感染可出现多种临床表现,包括急性、慢性、重型肝炎,可发展为肝硬化、肝癌,最终常因肝衰竭而死亡。上述复杂疾病谱的发病机制尚不清楚,目前一致认为其发病机制中免疫反应占主导地位,受MHC-Ⅰ类分子严格限制的抗原特异性CTL识别感染肝细胞是造成肝损伤的主要原因,抗原特异性CTL在HBV感染发病中具有重要作用。对HBV感染免疫发病机制的研究发现,HBV感染时抗原特异性CTL反应很弱,特别是慢性HBV感染,用传统检测抗原特异性CTL的方法,如有限稀释法(limiting dilution assays,LDA)、~(51)Cr释放试验法、酶联免疫斑点法等方法几乎检测不到,这种情况严重阻碍了HBV感染抗原特异性CTL的研究。自从1996年Altman等发明了MHC-表位肽四聚体技术以来,四聚体技术已经广泛用于基础和临床研究,也推动了HBV感染抗原特异性CTL的研究。四聚体技术直接检测抗原特异性CTL,无需体外扩增,是一种高效敏感的方法。四聚体复合物是用生物技术将MHC-Ⅰ分子的C末端接一个生物素化位点,然后与特异性表位肽结合为MHC-Ⅰ抗原肽复合物,再按照4∶1的比例结合在亲和素上成为MHC-Ⅰ四聚体复合物。四聚体复合物可同时识别针对这段表位肽的四个T细胞受体(T cell antigen receptor,TCR),与T细胞紧密结合,从而识别特异性CTL。四聚体技术具有很强的通用性,即相同的MHC表型个体之间,四聚体复合物可以通用,无需考虑T细胞受体的多样性。另一方面,四聚体复合物结构简单,对适用于相同MHC表型个体的各种四聚体复合物之间的差异仅在所采用的表位肽。因此,构建一个MHC-表位肽四聚体也就方便了其他肽特异性四聚体复合物的构建。四聚体技术用于HBV感染抗原特异性CTL的研究已有几年,但多限于核心抗原18-27、衣壳抗原335-343和多聚酶抗原575-583,而且所采用的病例数较少,难以反映HBV感染抗原特异性CTL的真实状态。因此,更多病例,更多抗原表位肽特异性
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392
【图文】：

示意图,结构组成,原理,示意图

等很难检测到，因而限制了HBV特异性细胞免疫的深入研究。对HBV感染患者特异性细胞毒性T细胞数量低的原因有多种推测，均未得到有效证实。同时，人逐渐认识到这些传统方法的一个共同点是采用体外活化的方法进行抗原特异TL的研究，它们只能检测到具有增殖、活化潜力的T细胞，因而肯定低估了抗原性CTL水平[’4]，改进检测方法将有助于抗原特异性CTL的研究。1996年Altman等I‘’]建立可溶性甩A一般肤四聚体复合物(tetrmaericeo帅lexes，arme)r法，为抗原特异性CTL的研究开拓了新的天地。可溶性HLA一A2肤四聚体物是通过基因工程技术将巧个氨基酸的BiAr酶底物肤B(SP)的编码基因克隆到质HLA一A2重链梭基端，表达HLA一A2重链一BSP融合蛋白。将融合蛋白、p一2微白、抗原表位肤(体外合成)折叠复合后与BirA酶作用，产生赖氨酸残基，再与藻白(PE)标记的亲合素混合，形成HL-AAZ重链、藻红蛋白一亲合素、p一2微球蛋白、位肤组成的四价复合体，四聚体复合物可以同时与四个TCR结合。四聚体复合物仿CTL识别靶细胞的“双识别”过程与TCR相结合，从而标记该IILA型、特定表位的CTL细胞。

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PCR扩增HAL一A2一BSP基因片段，片段大约30b7p子量标准条带，从下到上为:100Pb、200bP、300bp、400bp、500Pb、600p一微球蛋白M图1一4p一2微球蛋白表达质粒转化细菌PCR鉴定结果

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达质粒和p一2微球蛋白质粒转化感受态细菌，培养时间最长达36小时。」M109转化感受态细菌培养皿中无细菌生长，BLZID(E3)、BLZI(DE3)pLyss转化成功，但生长缓慢，在24小时左右才能看见。见图1一2(培养30小时)二、HL-AAZ一SP表达质粒和p一2微球蛋白质粒转化感受态细菌的鉴定1.挑取质粒转化感受态细菌在含氨节青霉素LB培养液中，37℃摇菌培养，培养液刚开始变浑浊时，取菌液进行PCR方法直接鉴定转化菌液，PCR产物采用2%琼脂糖电泳，见预计大小的阳性条带者为转化成功细菌。转化成功细菌PCR鉴定电泳结果见图l一3。

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