Akt调控TPP1寡聚化以及端粒保护
发布时间：2020-08-04 09:30
【摘要】：端粒是位于真核生物染色体末端的一种特殊结构，在维持基因组的稳定性和完整性中发挥着重要的作用。端粒损伤与衰老和癌症的发生存在密切地联系。在哺乳动物细胞中，越来越多的研究结果揭示了端粒核心相关蛋白在端粒处的组装过程以及端粒蛋白复合体如何招募端粒酶和其它蛋白因子来维持和保护端粒。然而，关于细胞生长信号通路变化对端粒以及端粒结合蛋白影响的研究却不是很清楚。作为研究的最为广泛和经典的细胞生长信号途径，磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号通路在调控细胞增殖、存活、代谢以及DNA修复等细胞功能中发挥着重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号通路出现紊乱与衰老、癌症和糖尿病等疾病的发生密切相关。 在我们的研究中，我们提供了充分的证据，证明了Akt信号通路在端粒保护中起着重要的作用。利用Akt信号通路的化学抑制剂或者小分子干扰RNA抑制Akt活性，均会引发端粒损伤。另外，我们还发现端粒蛋白TPP1可以通过其折叠结构域（OB）形成同源寡聚体，并且这个过程受Akt活性的调控。抑制Akt活性会破坏TPP1寡聚化并诱发端粒损伤，伴随着端粒蛋白TPP1和POT1在端粒处招募量的下降。总之，我们的研究结果建立了Akt信号通路和端粒保护之间新的联系。 主要研究结果如下： （1）Akt活性在端粒末端保护中起着重要作用。HTC75细胞利用血清饥饿处理过夜，细胞除了表现出细胞增殖受到抑制之外，还发现端粒处会有DNA修复指示蛋白53BP1的聚集，暗示了细胞端粒对营养条件的变化比较敏感，细胞生长信号通路可能在端粒维持和保护中起到正调控的作用。利用Akt活性特异抑制剂Triciribine处理细胞，端粒会出现明显的损伤信号，而细胞去除Trciribine之后端粒恢复正常，证明了Akt活性在端粒保护中发挥重要的作用。 （2）Akt活性对端粒蛋白TPP1和POT1在端粒处的招募起着非常重要的作用。利用Akt活性特异抑制剂Triciribine处理细胞，不会影响其端粒核心蛋白的表达水平，然而通过染色质免疫沉淀实验（ChIP）分析，试验结果表明了Triciribine处理后会降低端粒蛋白TPP1和POT1在端粒上的结合量。 （3）Akt1在端粒保护中起着最主要的作用。通过小分子RNA干扰实验证明了Akt1而不是Akt2或Akt3在端粒保护中发挥着最主要作用。另外，实验结果也证明了RNAi耐受的野生型Akt1而不是激酶失活型Akt1K179M能恢复（rescue）由于Akt1沉默诱发的端粒损伤。总之，Akt1的激酶活性在端粒保护中发挥着主要的作用。 （4）TPP1能够通过OB折叠结构域介导寡聚化。通过双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）实验，表明了TPP1可以在体内形成寡聚体。采用原核表达和体外纯化TPP1的OB折叠结构域，通过体外GST下拉实验发现TPP1通过OB折叠结构域介导寡聚化。野生型TPP1而不是OB折叠结构域缺失的TPP1能恢复（rescue）由于Akt1沉默诱发的端粒损伤，证明了TPP1寡聚化在端粒保护中发挥重要作用。 （5）TPP1寡聚化的形成受Akt1活性的影响。利用Akt活性特异抑制剂Triciribine处理或者小分子RNA干扰细胞，均会破坏TPP1寡聚化。在细胞中过量表达Akt1，能够加强TPP1寡聚化的形成；RNAi耐受的野生型Akt1而不是激酶失活型Akt1K179M能恢复（rescue）由于Akt1减少造成的TPP1寡聚化破坏。总之，Akt1的活性在TPP1寡聚化形成过程中起着关键作用。
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【图文】：
端的 T 环（T-loop）结构（图 1-1）。由于富含 G，它可形成一种由富含鸟嘌呤的核酸序列所构成的四股型态，称为端粒 G-四链体[18]。端粒的每四个TTAGGG 重复序列可形成一个端粒 G 四链体。在人类和老鼠细胞中通过电子显微镜观察交联之后去除蛋白的端粒 DNA，首次发现了端粒 T 环结构[19]，之后在鸡和老鼠中通过无交联非变性端粒染色体的分离同样也发现了 T 环结构的存在[20]。A
TRF2 的缺失会诱发小鼠以及人的染色体末端 ATM 激活[34, 83]。端粒伤反应可以引起 DNA 损伤反应因子γ-H2AX 和 53BP1 在端粒的聚集粒损伤诱导 foci（TIF, telomere dysfunction-induced foci）[84]会接着激活 p53 依赖的细胞周期阻滞和细胞凋亡[85, 86]。与 TRF2 不够抑制端粒发生 ATR 信号激活（图 1-3）[34]。在老鼠里面缺失两个因能引起端粒损伤反应，在这个过程中只有 ATR 的激活而不是 ATM，TRF2 和 POT1 相对独立的抑制端粒处可能会发生的两个主要的 D通路，防止端粒被误识别成 DNA 双链断裂而造成不必要的 DNA 修复端粒以及协调细胞周期的进行。
图 1-4 端粒调控网络（引自 Huawei Xin, Dan Liu and Zhou Songyang.2008.Genome BFigure 1-4 The telomere interactome图中显示了大多数已报道的以端粒蛋白为核心的蛋白相互作用网络。通蛋白相互作用，来实现对端粒保护和维持等功能的调控。DNA 损伤和修复信号通路相关蛋白在端粒功能调控中发挥用。TRF1 和 TRF2 与 DNA 损伤反应信号通路有着非常紧密的联TRF2 结合在端粒上，能够防止端粒被误识别成 DNA 断裂。TRF1作用，在体内和体外实验中 TRF1 都能被 ATM 磷酸化，磷酸化后粒 DNA 结合能力下降[94]。另外，ATM 介导的 TRF1 的磷酸化需 M参与[94]， MRN 复合体同样也对 TRF1 的活性起着调控作用。过
本文编号：2780361
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【图文】：
端的 T 环（T-loop）结构（图 1-1）。由于富含 G，它可形成一种由富含鸟嘌呤的核酸序列所构成的四股型态，称为端粒 G-四链体[18]。端粒的每四个TTAGGG 重复序列可形成一个端粒 G 四链体。在人类和老鼠细胞中通过电子显微镜观察交联之后去除蛋白的端粒 DNA，首次发现了端粒 T 环结构[19]，之后在鸡和老鼠中通过无交联非变性端粒染色体的分离同样也发现了 T 环结构的存在[20]。A
TRF2 的缺失会诱发小鼠以及人的染色体末端 ATM 激活[34, 83]。端粒伤反应可以引起 DNA 损伤反应因子γ-H2AX 和 53BP1 在端粒的聚集粒损伤诱导 foci（TIF, telomere dysfunction-induced foci）[84]会接着激活 p53 依赖的细胞周期阻滞和细胞凋亡[85, 86]。与 TRF2 不够抑制端粒发生 ATR 信号激活（图 1-3）[34]。在老鼠里面缺失两个因能引起端粒损伤反应，在这个过程中只有 ATR 的激活而不是 ATM，TRF2 和 POT1 相对独立的抑制端粒处可能会发生的两个主要的 D通路，防止端粒被误识别成 DNA 双链断裂而造成不必要的 DNA 修复端粒以及协调细胞周期的进行。
图 1-4 端粒调控网络（引自 Huawei Xin, Dan Liu and Zhou Songyang.2008.Genome BFigure 1-4 The telomere interactome图中显示了大多数已报道的以端粒蛋白为核心的蛋白相互作用网络。通蛋白相互作用，来实现对端粒保护和维持等功能的调控。DNA 损伤和修复信号通路相关蛋白在端粒功能调控中发挥用。TRF1 和 TRF2 与 DNA 损伤反应信号通路有着非常紧密的联TRF2 结合在端粒上，能够防止端粒被误识别成 DNA 断裂。TRF1作用，在体内和体外实验中 TRF1 都能被 ATM 磷酸化，磷酸化后粒 DNA 结合能力下降[94]。另外，ATM 介导的 TRF1 的磷酸化需 M参与[94]， MRN 复合体同样也对 TRF1 的活性起着调控作用。过
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 刘春荣;中国城市社区选举的想象:从功能阐释到过程分析[J];社会;2005年01期
本文编号：2780361
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