脂多糖结合蛋白功能位点分析及其抑制性多肽的筛选

发布时间：2020-08-04 21:23

【摘要】：脂多糖结合蛋白(LBP)是存在于正常人和动物血清中的一种糖蛋白,属于I型急性期反应蛋白,与脂多糖(LPS)的类脂A部分具有高度亲和性。LBP具有致炎和抗炎的双重作用。LBP既可将LPS多聚体转换为单聚体,加速LPS与其受体CD14结合,显著放大LPS的致炎作用;也可加速LPS与靶细胞膜上的清除受体结合,使LPS被靶细胞清除;还可催化LPS与脂蛋白结合,后者可中和LPS的生物学活性,加速体内LPS的清除。LBP的不同作用可能是由不同功能位点决定的。当LBP的某一功能位点与LPS的类脂A结合时,表现为对LPS的增敏作用;而当另一功能位点与LPS的类脂A结合时,则可增强LPS的内化,表现为对LPS的抑制性调理作用。本实验应用噬菌体呈现技术研究LBP的致炎功能位点和抗炎功能位点,并获得具有抑制LBP致炎活性的可溶性多肽。方法: 1. 采用经典的亲和富集法对噬菌体随机12肽库进行4轮亲和筛选, 以LPS为靶分子,前2轮采用酸洗脱,第3、4轮采用LBP竞争性洗脱,获得可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体克隆。应用结合实验和竞争抑制实验进一步确证。 2. 应用细胞因子生成抑制实验,即通过ELISA法测定人外周血单个核细胞培养上清中TNFα含量,对筛选出的噬菌体克隆进行功能性筛选,获得具有阻断LBP致炎作用的噬菌体克隆。通过流式细胞术观察LPS的内化,获得具有阻断LBP抗炎作用的噬菌体克隆。 3. 将获得的噬菌体克隆进行DNA测序,根据噬菌体克隆基因中所插入的外源DNA序列推导出呈现的外源多肽氨基酸序列。应用Blast软件将多肽序列与LBP分子的一级结构序列比较分析,对LBP的致炎和抗炎功能位点进行定位。 4. 根据获得的具有阻断LBP致炎作用的噬菌体克隆呈现的外源多肽序列,采用FMOC固相合成法化学合成具有阻断LBP致炎活性的游离型多肽。 5. 用细胞因子生成抑制实验检测合成多肽的抗炎活性。结果: 1. 采用亲和筛选方法,以LPS为靶分子,经过2轮筛选,从噬菌体随机12肽库 WP=11 中获得了可与LPS结合的噬菌体克隆。再经过2轮LBP竞争性筛选,获得了可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体克隆。 2. 从获得的可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体肽库中随机挑取100个噬菌体克隆,进行结合实验和竞争抑制实验。结合实验发现100个克隆中有72个克隆与LPS有较高的结合活性,进一步的竞争抑制实验表明其中16个噬菌体克隆具有与LBP竞争结合LPS的活性,进一步进行功能筛选。 3. 细胞因子生成抑制实验发现,9个噬菌体克隆可显著抑制LBP增敏LPS诱导PBMC分泌TNFα 的作用; LPS内化抑制实验表明,这9个噬菌体克隆均无抑制LBP增强LPS内化作用的活性,其展示肽具有抑制LBP致炎作用的活性。根据上述9个噬菌体克隆基因中插入的外源DNA序列推导出呈现的多肽序列,这9个噬菌体克隆融合多肽的核心序列为WKXRKXFXKXXG,LBP分子一级结构中有一个与多肽序列相似的序列,位于LBP分子的91-102位氨基酸WKVRKSFFKLQG,LBP的91-102位氨基酸片段可能为其致炎功能位点。 4. LPS内化抑制实验发现,3个噬菌体克隆具有抑制LBP增强LPS内化作用的活性;细胞因子生成抑制实验表明,这3个噬菌体克隆均无抑制LBP增敏LPS诱导PBMC分泌TNFα 的作用,这3个噬菌体克隆所展示的融合多肽具有抑制LBP抗炎作用的活性。这3个噬菌体克隆融合肽DNA序列一致,推导融合表达的12肽序列为FHTRWNYWPYLH,可以模拟LBP的抗炎功能位点。LBP分子一级结构中没有与FHTRWNYWPYLH相似的序列,提示该序列可能是LBP与LPS结合的一个模拟位点,而不是线性位点。 5. 应用FMOC固相合成法成功合成LBP致炎活性抑制肽,多肽序列为LBP91-102氨基酸序列WKVRKSFFKLQG-NH2,纯度在95%以上,分子量1523.6,与理论值相符。合成的LBP致炎作用抑制肽可显著抑制LBP增敏LPS诱导PBMC分泌TNFα 的活性。结论: 1. 本研究成功的从噬菌体随机12肽库中筛选获得了可与LBP竞争结合LPS的噬菌体克隆。 2. 筛选获得的具有特异抑制LBP致炎作用的噬菌体克隆展示肽的核心序列为WKXRKXFXKXXG,与LBP分子的91-102位氨基酸WKVRKSFFKLQG有明显同源性,LBP的91-102位氨基酸序列WKVRKSFFKLQG可能为其致炎功能位点。 3. 筛选得到的具有特异抑制LBP抗炎作用的噬菌体克隆展示肽的序列为 WP=12 FHTRWNYWPYLH,可以模拟LBP的抗炎功能位点。该序列与LBP分子一级结构同源性低,提示FHTRWNYWPYLH可能是LBP与LPS结合的一个模拟表位,可以模拟LBP的抗炎功能位点。 4. 应用FMOC固相法成功合成12肽WKVRKSFFKLQG-NH2,此多肽具有显著抑制LBP增敏LPS诱导PBMC分泌TNFα 的活性。上述研究研究结果对于阐明LBP在LPS所致内毒素血症中的分子结构基础,为进一步研究内毒素血症中致炎和抗炎的平衡关系奠定基础,并为内毒素血症的防治探索新途径。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346
【图文】：

质谱图,多肽,纯度,固相合成法

(4). TNFαELISA 检测方法同上。（三）、统计学处理各组数据以均数±标准差 ( x±s)表示，采用 SPSS10.0 统计软件进行方差分析和t 检验，P㩳0.05 为相差显著。结果1. LBP 抑制肽合成采用 FMOC 固相合成法成功合成具有 LBP 的 91-102 位氨基酸序列的多肽WKVRKSFFKLQG-NH2，并在其 C 端加 NH2修饰以增强其稳定性。合成后的粗肽经过脱盐后进行反向 HPLC 纯化，纯度超过 95%。得到的多肽纯品进行质谱分析测定分子量为 1523.6，与理论值相符，说明合成的多肽结构正确，纯度合乎测试要求，可用于生物学活性的检测与评价。合成肽的质谱图见图 35，色谱图见图 36。

HPLC色谱,增敏,含量差别,生物学活性

图 36 LBP 抑制肽 HPLC 色谱图Fig36 The HPLC cromatogram of LBP inhibitor peptide2. LBP 抑制肽的生物学活性鉴定（1）不同浓度 LBP 抑制肽对 LBP 增强 LPS 诱导 PBMC 分泌 TNFα的抑制研究发现 PBMC+rhLBP 组、PBMC+20μM peptide 组、PBMC+rhLBP+2ide 组与 PBMC 组之间 TNFα含量差别不显著（P㧐0.05），表明 rhLBP 和 L均无直接增强或抑制 LPS 致炎作用；PBMC+LPS 组 TNFα含量显著高于 PP㩳0.01），PBMC+LPS+LBP 组 TNFα含量显著高于 PBMC+LPS 组（P㩳0.01BP 具有增敏 LPS 致炎作用； 0.02μM 抑制肽使 LBP 增敏 LPS 诱导 PBMCα有下降趋势，但无统计学差异（P㧐0.05）；而 0.2μM 抑制肽即有显著抑P㩳0.05），这个浓度为 LBP 抑制肽显著抑制 10ng/ml LBP 增强 10ng/ml LPS

流式细胞分析,流式

PBMC空白对照的流式细胞分析

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