甘露聚糖结合凝集素对人外周血单核细胞分化为调节性树突状细胞的作用及其机制的初步研究

发布时间：2020-08-04 21:35

【摘要】：甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)属于血清C型凝集素,是机体天然免疫的重要分子之一,这种高度保守的糖蛋白主要由肝细胞合成并以三聚体亚单位组成的多种寡聚体形式在血清中循环,其寡聚体形式可广泛识别多种病原体表面的糖结构,并通过激活2个MBL相关丝氨酸蛋白酶(MBL associated serine proteases, MASP-1, MASP-2)以不依赖于抗体和Clq的方式激活补体系统,发挥细胞溶破和间接调理功能。目前已知的MBL受体包括吞噬细胞表面胶凝素受体,能通过二者的结合而起直接调理作用,并在调节炎症和启动细胞调亡过程中发挥作用。MBL、Clq和SP-A、SP-D属于可溶性模式识别受体(Patteren Recognition Receptor, PRR),是防御性胶原家族成员。而PRR的配体称为病原体相关分子模式(Pathogen-Associated Molecule Pattern,PAMP),是一组或几大组病原体所共有、对其生存绝对必要且宿主机体没有的保守成分。MBL能够以其球状羧基端识别病原体表面特异性PAMP,引发机体迅速有效的保护性免疫应答。此外,MBL对病原体具有广谱识别作用,可结合免疫球蛋白；参与对凋亡细胞的吞噬以及MBL依赖的Th细胞活化和细胞介导的细胞毒作用。近年发现,大鼠MBL可以刺激肝脏Kupffer细胞对大肠杆菌及金黄色葡萄球的吞噬；重组人MBL可促进单核巨噬细胞株THP-1对大肠杆菌的吞噬。另一方面,细胞因子和抗原提呈细胞在决定感受到危险信号后所发生的免疫应答的类型和强度时具有重要作用。MBL可与单核细胞(Monocyte, Mo)和树突状细胞(Dendritic cells, DC)结合,调节细胞因子的分泌,抑制LPS/CD14诱导的单核细胞释放炎性细胞因子TNF-α,同时上调抑制性细胞因子的分泌；抑制DC-SIGN介导的对T细胞的感染。研究表明,胶凝素家族成员肺表面活性物质相关蛋白SP-A、SP-D亦可与多种免疫细胞如单核细胞、树突状细胞、T细胞结合,在天然免疫和获得性免疫应答中发挥调节功能,如增强吞噬细胞表面受体的表达,调节细胞因子和自由基的释放,清除自身凋亡细胞。树突状细胞是机体内功能最强的专职抗原提呈细胞,且能够通过分泌特异性的细胞因子和与T、B细胞的相互作用有效启动免疫系统和介导免疫调节。研究者最初对于DC的认识并无抗原摄取功能,但随后发现DC在吞噬活性、迁移能力和介导获得性免疫应答系统方面皆具有其精确的阶段性调控机制,能够有效地刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化,从而启动和调节获得性免疫应答,故在免疫应答的诱导中具有独特的地位。但是由于DC在人体内的数量有限且功能复杂多样,对于其体外分化发育、抗原提呈、功能调控等诸多方面的研究存在着许多空白。最初的体外实验发现,人源未成熟DC可以诱导异体抗原反应性Treg的生成,而新近研究表明,在机体处于感染状态时,由病原体释放的Toll样受体(Toll like receptor, TLR)激动剂能够在Mo分化早期抑制其分化为常规未成熟DC,而发展为CD14+CD1a-的调节性细胞亚群。此外,应用Yssel's培养基能够将Mo来源DC诱导为以CDla-产生IL-10而无IL-12分泌为特征的免疫抑制型DC亚群,同时发现,新分离单核细胞的初始24h是改变DC后期表型的重要阶段,此后再加入刺激因素,DC将倾向于向常规方向分化。其中,CD1家族分子在体内抗微生物感染过程中主要负责脂类抗原提呈,在Mo细胞来源DC的分化早期高表达,是DC分化发育中的标志性表面分子。CDla的表达往往适应于DC的功能需要,细胞捕获抗原时常见CDla高表达,当细胞处于抗原提呈状态时,其表达水平相应下调。病理条件下,CDla往往表达在CD83+的DC亚群中,已有研究证实,CD1蛋白是诱导有效细胞免疫的必要条件,其表达与麻风病分型直接相关。CD1+CD83+单核细胞来源的DC对于鉴别Mo的分化方向、活化CD1限制性T细胞起重要作用,且在临床治疗及预后监测中具有指导性意义。本课题通过体外分离培养人外周血单核细胞并诱导其分化为DC,在各实验组中加入MBL及其它刺激因素,分别在DC的早期分化阶段、未成熟阶段和成熟阶段连续观察细胞形态,检测细胞表面分子标志、细胞功能及其相关机制,阐明MBL在此过程中的作用。初步揭示了MBL可通过调节单核细胞的分化方向,促进CD14+CD1alow调节性树突状细胞亚群的生成,并影响树突状细胞各发育阶段的表型和功能,从而有效联系机体天然免疫和获得性免疫系统,最终发挥抵抗病原体感染和调节体内免疫应答强度的双重作用。第一章MBL对人外周血单核细胞诱导为调节性DC的研究 CDla分子是一类具有与MHCI和MHCII高度同源性的兼具抗原肽的识别与提呈功能的非典型抗原提呈分子。多数研究表明,只有郎格罕斯细胞(LC)和某些皮肤DC及胸腺细胞能够表达CDla,此外,CDla的表达水平与DC的成熟状态密切相关,未成熟DC高表达CDla,具且有较强的抗原捕获能力,而随着DC在抗原刺激下的逐步成熟,其抗原提呈能力提高而捕获抗原能力下降,此时CDla的表达也随之减少。本实验中,取健康人外周血采用密度梯度离心法和磁珠分选获得高纯度单核细胞,联合应用IL-4和GM-CSF成功诱导出大量DC细胞。在单核细胞向DC诱导分化的早期阶段(d0),分别加入MBL和无关蛋白HSA,经常规培养,分别在第2天和第5天收获细胞,采用流式细胞术检测细胞表面Mo标志性分子CD14、CDllb的表达水平,同时检测DC标志性共刺激分子CD80、CD40、CD86、 CDla、CD83以及MHCⅡ类分子HLA-DR的表达,并通过PCR和ELISA分别在基因和蛋白水平检测MBL对细胞因子表达谱的影响。结果表明,MBL刺激组获得DC细胞数明显少于对照组(F=7.169,P=0.026,多重比较结果P0.01),且无凋亡现象发生,提示MBL可能以非调亡方式抑制单核细胞向常规DC方向的分化,同时我们观察到,该DC前体细胞持续表达单核细胞标志CD14,上调CD11b表达,而常规DC标志分子CDla低表达,CD80、 CD40和HLA-DR水平均下调(FCD80=0.216, PCD80=0.667, FCD40=0.242, PCD40=0.649,多重比较P CD800.05, P CD400.05; FHLA-DR/d2=3.582, P HLA-DR/d2=0-095,多重比较P HLA-DR/d20.05; FHLA-DR/d5=3.113, PHLA-DR/d5=0.118,多重比较PHLA-DR/d50.05),在此检测期内CD83仅少量表达。该细胞亚群以分泌IL-10、IL-6为特征(FIL-10=4.890, PIL-10=0.055, FIL-6=4.111, PIL-6=0.075,多重比较P IL-100.01, P IL-60.01),几乎无IL-12分泌(FIL-12=2.133, PIL-12=0.200,多重比较P IL-120.01),,几乎无IL-12分泌,因此推测在DC分化早期加入MBL,可能诱导出与常规DC表型和功能不同的DC细胞亚群。此部分工作首先为后续的机制研究提供了充足稳定的MBL蛋白,经鉴定,MBL纯度较高且能够保持其天然生物活性,采用磁珠分选获得了高度纯化的单核细胞并具备良好的细胞活力用于DC细胞体外诱导,该诱导方法稳定、可重复性高,保证了实验所需的DC细胞来源。同时,初步确定了MBL可能诱导早期单核细胞分化为调节性DC亚群,针对这一现象,完成了对DC细胞表型和细胞因子表达特征的检测。第二章MBL对单核细胞诱导为调节性DC亚群的机制及功能的初步研究最近研究表明,浆细胞来源DC分泌低水平IL-12并促进T细胞向Th2亚群分化,而单核细胞来源DC则通过产生高水平IL-12诱导T细胞向Thl型分化。由于该研究中的DC细胞来源于不同的细胞前体,而同一细胞群体是否能分化出功能各异并且分泌不同细胞因子的DC亚群尚不得而知。Yssel等发现在诱导人外周血单核细胞向DC分化的常规培养基中加入胰岛素、转铁蛋白、亚麻油酸、油酸及棕榈酸能够促使单核细胞分化为CD14+DC,该细胞亚群即使在LPS和IFN-γ的刺激下仍然表现为CDla-并且不分泌IL-12,研究人员将该类DC细胞定义为mDC2,并且证实,其显著特征为CDla—和缺乏IL-12表达,并且能够调节T细胞的分化方向,促进产生Th0/Th2细胞。髓系DC的分化往往依赖于GM-CSF的激活,GM-CSF通过特异性非受体酪氨酸激酶JAKs和信号传导和激活转录因子STAT,尤其是JAK2和STAT5介导的信号通路发挥作用。由此,本实验将该细胞亚群与T细胞混合培养,结果表明在分化早期受到MBL刺激的未成熟DC具有抑制T细胞增殖活化,抑制其IFN-y分泌的功能,结果有统计学差异(F1：5=2.280,P1：5=0.183,多重比较P1：50.01；F1:5(anti-CD3/CD28):=8.544, P1:5(anti-CD3/CD28)=0.018,多重比较P1:5(anti-CD3/CD28)0.05, F1:20(anti-CD3/CD28)=3.527, P1:20(anti-CD3/CD28)=0.097,多重比较Pi:20(anti-CD3/CD28)0-05)。CDla低表达和IL-12缺乏影响这类细胞的抗原提呈功能,但是并不影响其对抗原的摄取能力。同时,通过Westernblot信号通路分析,发现MBL可显著抑制STAT5、JNK表达以及胞外信号调节激酶ERKl磷酸化水平,而刺激PU.1、STAT3活性增强,由此证实了粒细胞巨噬细胞集落刺激因子依赖性STAT5/JAK2通路可能为MBL的作用靶点,从而调控细胞表型及其细胞因子表达谱。此外,实验证实该DC细胞亚群在LPS刺激下仍能够分化为CD83+DC。第三章MBL对人单核细胞来源DC成熟的影响及机制的初步研究在本实验室已有DC研究基础上,本部分实验深入探索MBL对人单核细胞来源DC成熟的影响及其机制。首先常规诱导培养DC,在第5天获得表型和功能稳定的未成熟DC细胞(imDC),继续培养2天,其中实验组加入MBL,在相同培养条件下加入HSA作为无关蛋白组,在第7天收集成熟DC及培养上清,采用流式细胞术、ELISA,在细胞分子水平分别检测MBL对人单核细胞来源的DC成熟的影响,并通过Western Blot在蛋白水平对刺激因素靶向调控的信号通路机制予以证实。结果提示,在天然免疫识别分子MBL存在的条件下,DC表面分子CD83、CD86、CD80、CD40和MHCⅡ类分子HLA-DR的表达均上调,且能促进同种异体非抗原特异性T细胞增殖。与DC前体细胞向未成熟DC分化的作用相反,MBL在未成熟DC向成熟DC发育的过程中刺激STAT5表达,抑制STAT3和SOCS活化,上清中IL-12、表达显著增加(FIL-12=1.468,PIL-12=0.295,多重比较P＜0.05), TNF-α分泌无统计学差异(FTNF-α=1-049, PTNF-α=0.422,多重比较P=0.973)。提示MBL促进未成熟DC向成熟DC的转化,通过影响抗原提呈细胞在其各个发展阶段的功能,调节天然免疫应答强度,最终指导人体的获得性免疫系统的应答。综上所述,MBL作为识别和清除入侵病原体的重要防御性分子,在发挥宿主天然免疫应答的作用之外,我们的工作证实了MBL能够通过调节APC的分化发育和功能而参与获得性免疫应答,尤其能够在Mo向DC分化早期影响其分化方向,在此特定的发育阶段内促进调节性DC亚群的形成。这类CD14+CD1alowDC细胞以分泌IL-10、IL-6,低水平分泌IL-12为其特征,低表达多种表面共刺激分子,负向调节初始T细胞应答。此外,我们通过对其分子机制和信号传导通路的分析,初步揭示了MBL调节DC发育的双重作用,可能是MBL作为天然免疫防御蛋白在感染等病理条件下参与调控机体的免疫应答强度以及自身免疫性疾病的发生发展的机制之一。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【参考文献】