三型分泌系统针状蛋白和梭菌大毒素激活炎症小体的分子机制

发布时间：2020-08-08 05:01

【摘要】：炎症小体通路主要存在于巨噬细胞和树突状细胞中,在机体的炎症反应中起着非常重要的作用。炎症小体的激活通常导致半胱氨酸蛋白酶原caspase-1的自我剪切。自我剪切后的caspase-1组装成活性形式,一方面切割细胞因子IL-1β和IL-18成为成熟形式从而分泌进入血液发挥作用,另一方面开启一种巨噬细胞和树突状细胞所特有的炎性细胞死亡(pyroptosis)。炎症小体的激活通常依赖于一类驻扎在细胞质内的受体分子NLR(Nod Like Receptor)。 NLR是一个大的蛋白家族,在人基因组中有23个成员,鼠中有34个,它们的共同特征是具有一个中间的NBD结构域。在这些NLR中,大多数成员的功能是未知的。在炎症小体的研究中,很重要的一部分工作就是揭示这些NLR的功能和作用的机制。大多数具有Ⅲ型分泌系统的革兰氏阴性菌在感染巨噬细胞和树突状细胞的时候都能够引起炎症小体的激活,并且当敲除NLRC4(NLR家族的一员)后,激活会大大的减弱,这一类炎症小体被称为NLRC4炎症小体。之前的研究表明,NLRC4炎症小体的激活是由于NLR的一个亚家族,NAIP家族蛋白识别了来自于病原菌的鞭毛蛋白或Ⅲ型分泌系统基座蛋白所致。在常用的小鼠品系中,巨噬细胞表达的NAIP蛋白有四个,NAIP1,NAIP2,NAIP5和NAIP6。其中NAIP5/6识别鞭毛蛋白,NAIP2识别Ⅲ型分泌系统基座蛋白。而NAIP1的功能未知。与小鼠中不同的是,人的基因组中仅有一个NAIP(hNAIP)。因此,人的NLRC4炎症小体是否具有功能,hNAIP在人类的天然免疫系统中是否具有和鼠的NAIP2/5/6类似的作用是一个非常值得研究的课题。本文以一种特殊的具有Ⅲ型分泌系统的革兰氏阴性菌----紫色杆菌----为工具,通过对紫色杆菌的遗传操作,发现Ⅲ型分泌系统的一类结构蛋白----针状蛋白,可以激活人源和鼠源巨噬细胞中的NLRC4炎症小体。对机制的进一步研究表明,人基因组中唯一的NAIP基因hNAIP和其在小鼠中的同源分子分别在人和小鼠的巨噬细胞中负责识别针状蛋白,从而形成NLRC4炎症小体,激活caspase-1。在人源的巨噬细胞中,沙门氏菌和志贺氏痢疾杆菌感染所引起的caspase-1激活都依赖hNAIP对针状蛋白的识别。在小鼠的天然免疫细胞中,病原菌感染激活NLRC4炎症小体的情况比较复杂,由哪一种NLRC4炎症小体起主导作用取决于细胞类型和细菌两个因素。我们的研究发现由志贺氏痢疾杆菌感染NAIP1高表达的小鼠树突状细胞系DC2.4时主要依赖于其针状蛋白通过NAIP1激活NLRC4炎症小体。我们对于针状蛋白-hNAIP/NAIP1-NLRC4通路的揭示对人和老鼠的天然免疫反应都有重要意义。除了NLRC4炎症小体外,现在已知的炎症小体主要包括NLRP3炎症小体,AIM2炎症小体和NLRP1b炎症小体。之前的研究表明,与家族性地中海热相关的一个基因Mefv编码的蛋白Pyrin在过表达时可以引起ASC点状复合物的形成,因此猜测有Pyrin炎症小体的存在,但是其功能一直未被发现。来自于革兰氏阳性菌艰难梭菌的一个毒素—-TcdB——可以激活巨噬细胞中的caspase-1。TcdB是一个糖基转移酶,其进入细胞后可以引起小G蛋白switchI区域的糖基化而处于失活状态。运用细胞生物学和小鼠遗传学的方法,我们发现TcdB引起caspase-1的激活依赖于Mefv基因——Mefv基因编码了Pyrin蛋白。因此,我们首次发现了Pyrin炎症小体的生理功能。进一步的研究表明,一系列可以共价修饰小G蛋白亚家族Rho蛋白swithI区域并使其失活的毒素/细菌效应蛋白都能激活Pyrin炎症小体,这暗示Pyrin炎症小体的激活很可能是通过一种全新的生化机制。不仅如此,免疫系统识别自身分子的非正常修饰在哺乳动物细胞中也是首例。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R364.5
【图文】：

结构域,分子机制,细胞的,方式

研究者认为在人群中之所Ｗ有这么滃的突变率，是由于其突变体可能会帮助携带者逡逑更好地抵御某种未知的致病因子。从蛋白的二级结构上来看，Ｐｙｒｉｎ包含Ｗ下几个逡逑结构域，如图１－３－１所示，Ｎ端１－９５ａａ是ｐｙｒｉｎ结构域，２６６－２８０是ｂＺＩＰ结构域，逡逑被认为和转录相关，３７５－４０７是Ｂ－ｂｏｘ邋ｚｉｎｃ邋ｆｉｎｇｅｒ结构域，紧随其后（４０８－５９４）逡逑由一个ｃｏｉｌ－ｃｏｉｌ结构域组成，５９８－７７４则是一个Ｂ３０．２结构域。自从Ｍｅｆｖ基因被逡逑发现Ｗ来，关于其功能的研究有很多，但是其确切的生理功能仍然未知。由于其具逡逑有Ｎ端的ｐｙｒｉｎ结构域，人们将之与ＡＳＣ巧表达并发现过表达的Ｐｙｒｉｎ可Ｗ引起逡逑ＡＳＣ点状复合物的形成，因此猜测其与炎症小体的激活有关［４３］。鼠的Ｍｅｆｖ基因逡逑和人的基本相似，也是Ｎ端具有一个ｐｙｒｉｎ结构域，后面具有Ｂ－ｂｏｘ和ｃｏｉｌ－ｃｏｉｌ结逡逑构域，仅在Ｂ３０．２结构域上有一些差异。然而敲除Ｍｅｆｖ的小鼠没有明显的发育上逡逑的缺陷

鞭毛蛋白,军团菌,蛋白,肺炎

属于ＮＬＲ家族的ＮＡＩＰ亚家族，这个家族ｉｐｌ，邋Ｎａｉｐ２，Ｎａｉｐ３，邋Ｎａｉｐ４，邋Ｎａｉｐ５，邋Ｎａｉｐ人的基因组中，仅有一个ＮＡＩＰ。因此，一识别鞭毛蛋白和基座蛋白而激活炎症小人的巨枿细胞中ＮＬＲＣ４炎症小体具究，我们选取了常用的人源单核细胞系Ｕ贴壁的巨枿细胞用于实验。这个细胞用于，可Ｗ检测到ＡＳＣ、ｃａｓｐａｓｅ－１和ＮＬＲＣ４菌的感染试验。逡逑室成熟的ＬＦｎ－ＰＡ蛋白转染系统，将鞭毛。结果表明，这两个蛋白都不能引起ｃａｓｐ可Ｗ很好的激活ｃａｓｐａｓｅ－１邋（见图２－２－１－１），Ｗ发生的。所ｉＵ，我们需要回答的首要问题有功能。鉴于炎症小体在免疫细胞中扮。逡逑

细胞,相对量,菌株,情况

：志贺氏荆疾巧菌（左卿沙口氏菌（右）感染ＰＭＡ检测上清中ｃａｓｐａｓｅ－１激活的情况。ｘＭｘｉＨ指和ｘ菌株。检测细胞中的Ａｃｔｉｎ作为Qg参。逡逑１．２邋Ｉ逦；逦逡逑■邋Ｐｒｉｍｅｒ邋ｓｅｔ邋１逦＾邋■邋Ｔｉ＂逡逑１．０邋．邋Ｔ邋Ｔ逦■邋Ｐｒｉｍｅｒ逦＾Ｈ｜Ｈ｜邋Ｉ逡逑ｉ邋：逦Ｉ逦ｌ｜逡逑＂ｉｉｌＭ逡逑ｓｈＲＮＡ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＮＬＲＣ４逦Ａｓｃ逡逑；实时英光定量ＰＣＲ结果显示，和阴性对照细胞相中ＮＬＲＣ４邋ｍＲＮＡ的相对量低于４０％。而Ａｓｃ敲没有变化。逡逑

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