骨髓间充质干细胞成肌诱导分化策略及其分化机制的研究

发布时间：2020-08-08 13:02

【摘要】： 骨骼肌占全身体重的40-45%，由肌细胞与神经、血管组成，是机体重要的运动器官之一。各种创伤如车祸伤、枪弹伤、烧伤及部份内科疾病如糖尿病、肿瘤和瘫痪所致的肢体坏疽都常伴肌组织损伤。正常肌肉再生主要由肌卫星细胞（satellite cell，SC）完成，但SC数量少，且随年龄增长而下降。对于严重或面积较大的肌损伤，SC不足以达到修复目的，创面最终被纤维结缔组织替代而形成瘢痕，导致难愈性创伤，使机体运动失能并影响神经、血管系统。利用组织工程技术，将适宜种子细胞附着在可选生物材料上植入肌损伤部位，促进肌损伤早期修复是目前肌修复研究中的热点课题。有学者将SC接种到聚羟基乙酸（polyglycolic acid，PGA）上植入动物腹腔大网膜中，发现30-40d后可形成含血管的功能性肌组织，但SC采集中的有创性、难获得性及含量少的缺陷制约了其作为种子细胞的应用。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有向骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞、成肌细胞及神经细胞在内的多种细胞分化的潜能，来源丰富，易于分离和培养，在体外可高度扩增。1995年，Wakitani首先利用5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-Aza-CR）诱导MSCs分化为成肌细胞，为MSCs应用于肌分化研究打下了基础，但MSCs成肌分化的具体机制却未见报道。肌细胞的分化成熟受生肌调节因子（myogenic regulatory factors,MRFs）调控，这是一类称为成肌碱性螺旋-环-螺旋的转录因子[myogenic basic helix-loop-helix(bHLH) transcription factors]，目前发现有Myf5、MyoD、myogenin和MRF4四种因子。MRFs家族基因在非肌细胞中异位表达时，可激活被表达细胞向成肌细胞分化，因此，推测5-Aza-CR诱导MSCs成肌分化时，MRFs相关基因的诱导表达可能是其分化的前提。干细胞的分化过程是细胞感应外源刺激信号，实现信号的跨膜转导的过程。了解信号转导途径对于进一步阐明基因调控机制，通过促进信号转导通路来促进干细胞定向分化有着重要意义。丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是信号从细胞表面转导到细胞内部的重要传递者，包括细胞外调节蛋白(extracellular regulated protein kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、应激 WP=10 活化蛋白激酶p38(stress-activaed protein kinase p38)及ERK5，该信号转导家族在细胞生长、应激和细胞间功能同步等多方面具有重要作用。在SC成熟分化过程中，磷酯酰肌醇-3（羟基）激酶（phosphatidylinositol 3-OH kinase,PI3K）的激活可启动其下游转录子Akt，促进SC的成肌分化。胰岛素样生长因子-I（insulin-like growth factor,IGF-I）可以明显增强SC成肌分化的信号转导，促进肌分化，而在MSCs成肌分化中的作用尚无报道。若对比分析MSCs与SC成肌分化之间的调控差别，将从理论上深入阐明MSCs成肌分化的相关机理，在实践上更好将MSCs应用于肌损伤修复。 SC正常时处于静止状态，在相关应激如创伤情况下被激活，表达MRFs而定向成肌分化。当SC受刺激后约3-12h，SC即开始表达MyoD/Myf5。但什么是诱导SC表达成肌分化调控因子的直接因素尚未可知。肌损伤伤口液中丰富的细胞因子和生长因子可能是潜在的诱导因子，但迄今尚不能肯定这些因子具有诱导SC成肌分化的作用，仅发现它们具有促进或抑制SC增殖和分化的功能。有学者将单纯的MSCs和经5-Aza-CR诱导后的MSCs植入损伤后的心肌处，发现可明显促进心肌再生，增强心室心肌收缩能力，尤其经5-Aza-CR诱导后的MSCs组效果显著，但对创面中的局部因素对MSCs成肌分化的影响却未见分析。本研究以MSCs成肌分化的基因调控及信号转导等分子机制为出发点，通过与SC成肌分化的过程比较，证实MSCs定向肌分化的相关机理；同时通过不同类型MSCs的移植，观察其在肌损伤部位的分化情况，探讨MSCs用于肌损伤修复的有效途径。主要实验方法及结果如下：一、骨髓间充质干细胞成肌诱导分化策略的研究： 1、浓度的选定：分别选用0、1、3、5、10、20（μmol/L）浓度的5-Aza-CR作用于MSCs，以MTT法分析不同浓度5-Aza-CR作用后，Balb/C小鼠MSCs的增殖情况，发现以5μmol/L、10μmol/L浓度为刺激MSCs增殖分化的最佳浓度。 2、成肌相关基因表达的检测：以5、10μmol/L两组浓度5-Aza-CR作用于MSCs，RT-PCR检测诱导后生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）及成肌素（myogenin）的表达，结果发现，10μmol/L组诱导6h，MSCs开始表达Myf5，9h达最高；5μmol/L组诱导9h，MSCs开始表达Myf5，12h达高峰。10μmol/L组诱导24h，MSCs开始表达myogenin，48h达最高；5μmol/L组诱导6d，MSCs开始表达myogenin，且为高峰。 3、成肌相关蛋白的检测：以5、10μmol/L两组浓度5-Aza-CR作用于MSCs，免疫组织化学染色法检测诱导后肌分化下游蛋白结蛋白（desmin）、α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric）及肌球蛋白（myosin）的表达。结果发现，10μmol/L 5-Aza-CR诱导7d，部份MSCs表达desmin阳性，至14d表达程度明显增强；5μmol/L 5-Aza-CR WP=11 诱导10d，MSCs表达desmin阳性。10μmol/L 5-Aza-CR诱导10d，部份MSCs表达α-sarcomeric阳性，
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R329.2

【参考文献】