登革病毒检测基因芯片的研制研究

发布时间：2020-08-09 04:42

【摘要】：登革病毒感染是一种蚊传播疾病，主要流行于热带、亚热带地区。在临床上，登革病毒感染可引起登革热、登革出血热或登革休克综合症。近年来，登革热、登革出血热或登革休克综合症的发病率不断升高，全球每年有大约0.8～1亿登革热和25～50万登革出血热或登革休克综合症患者。对登革病毒感染目前尚无有效的预防及治疗措施，对患者进行早期诊断是监控登革热流行和控制疾病发展的有效措施。 近年来国际上兴起的一种新型基因检测技术——基因芯片技术，为登革病毒感染的早期诊断提供了一种快速、高效、敏感、经济、自动化的方法，并可同时进行登革病毒基因的检测和分型。 在分类上，基因芯片基本上可分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片两种。本论文针对登革病毒感染研制可用于登革病毒基因早期诊断的cDNA芯片和寡核苷酸芯片。 cDNA检测芯片采用cDNA文库法收集探针：以2型登革病毒16681株的cDNA质粒为材料，利用长片断PCR技术扩增2型登革病毒的全长cDNA，Sau3A Ⅰ酶切长片段扩增产物，利用耐热性DNA聚合酶对酶切后形成的粘性末端进行补平加A；纯化补平加A产物，将其克隆到T载体上。对克隆进行PCR鉴定，结果获得142个阳性克隆。采用巢式PCR扩增制备探针，用PixSys 5500型基因芯片打印仪将探针点样到氨基硅烷包被的玻片上，制备登革病毒cDNA检测芯片。通过对逆转录及马文丽、郑文岭等建立的RD技术两种标记方法的比较分析，结果显示采用RD技术标记的样品，获得的杂交信号强，灵敏度高，故在后续的杂交分析中均采用此标记方法。在42℃、52℃、62℃三种不同的杂交温度条件下，分别将登革病毒cDNA芯片与人DNA及大肠杆菌DNA杂交，摸索到能减少非特异性杂交、提高芯片检测特异性的62℃高温杂交体系。在此杂交体系下，cDNA芯片与登革病毒样品杂交均有较强的阳性杂交信号，根据较特异的杂交图谱，可实现对登革病毒基因的有效检测。同时用登革病毒cDNA芯片与人基因组DNA、大肠杆菌DNA、丙肝病毒cDNA和乙脑病毒cDNA进行非特异性杂交分析，筛选到8个特异的登革病毒探针，拟作为针对多种病原体检测的集成芯片探针。进一步将9份登革病 毒广东地方分离株样品与登革病毒cDNA芯片杂交:进行重复性实验脸一 证，结果均能得到杂交信号较强的阳性结果， 革病毒基因检测的可靠性。 初步证实了该芯片用于登 寡核昔酸芯片的制备方法有原位合成法和合成点样法两种，原位合 成法有严格的专利限制，故采用合成点样法制备登革病毒寡核营酸芯片。 首先利用在线的BLAST检索程序分别对4种型别登革病毒序列进行同源 性分析，找出各型登革病毒的特异性序列区段，然后遵照探针设计的一 般原则，采用生物学软件011906.0在特异性区段筛选长度为60bP的寡核普 酸探针，使各探针的GC含量、Tm值、发夹结构等重要参数尽量趋于一 致。考虑到样品标记时，需行Sau划I酶切消化，因而我们在设计探针 的过程中也进行了Sau 3AI酶切位点分析。最终我们设计了22条60一mer的 登革病毒寡核营酸探针。人工合成寡核普酸探针，用Pixsys 5500型基因 芯片打印仪将探针打印、固定在多聚一L一赖氨酸包被的DAKO玻片上。应 用RD一技术标记各型登革病毒样品及人基因组DNA，然后分别与寡核普 酸芯片进行杂交，杂交结果显示:人基因组DNA与芯片无非特异性杂交， 而各型登革病毒样品与芯片均有特异性杂交，且各型登革病毒样品只与 自身相应的型特异性探针杂交，不与其它型别的检测探针杂交，说明寡 核普酸芯片的特异性高，可用于登革病毒基因的检测和分型。
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346
【图文】：

二、结果1.长片断PCR扩增2型登革病毒全长cDNA图1一4为长片断PCR扩增2型登革病毒全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果。可以看出扩增产物为特异的单一条带，其片断大小与预期相符，约10.7kb。M1以以汉0(5八U，犷5J.J工.25(1OC图1一4长片断PCR扩增产物的电泳图Fig.l一4:0.6%agarosegelelectroPhoresisoflongPCRProductsofdenguevirus2.LaneM:DL2000marker;Lanel:longPCRProduets.2.2型登革病毒cDNA文库的构建长片断PCR扩增产物经Sau3AI酶切、AT克隆得到的白色菌落经扩大培养后，用pMD18一T载体引物50100、50101进行PCR扩增，并用2.0%的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，结果可见分子质量不同的DNA条带(见图1一5)。通过PCR初步鉴定方法，共筛选到142个克隆片段大小为100~1000bp的阳性克隆。

用ABIPRIsMTM310自动测序仪对部分阳性克隆片段进行序列分析，将所得序列分析结果与GenBank数据库进行Blast序列比对，结果证明阳性克隆均来自于2型登革病毒。图1一6为其中一个克隆片断的测序结Fig.l一6SequencingofoneofeDNAfragmentsfromDenguevirus2elones·

M12345678910111213八U八Un甘n甘﨑h汽U50710内乙1图1一5克隆的PCR鉴定电泳图Fig.1一5:PCRidentifieationofdenguevirusserotyPe2eDNAfragmentselones.3.克隆片段的序列测定与Genebaxlk同源性比较用ABIPRIsMTM310自动测序仪对部分阳性克隆片段进行序列分析，将所得序列分析结果与GenBank数据库进行Blast序列比对，结果证明阳性克隆均来自于2型登革病毒。图1一6为其中一个克隆片断的测序结

【引证文献】

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1 马孟根;猪源致病性沙门氏菌耐药基因PCR和基因芯片检测技术研究[D];四川大学;2005年

本文编号：2786623