体外筛选炭疽杆菌芽孢适配子的研究与初步应用

发布时间：2020-08-09 03:53

【摘要】： SELEX技术(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment)即指数扩增配体的系统进化技术，是90年代初建立的一种体外文库筛选方法。SELEX技术的基本思想是合成一个两端为固定序列，中间为随机序列的单链寡核苷酸库(RNA或DNA)，库中序列的多样性可反映为二级结构的多样性；将它与靶物质混合，形成靶物质—寡核苷酸的复合物，去除未与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此类核酸分子为模板由固定序列为引物进行PCR扩增，扩增产物再进行下一轮的筛选过程；通过多轮的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质只有低亲和力的寡核苷酸被去除，而与靶物质有较高亲和力的“适配子”(Aptamer)将逐渐得到富集。这一方法的原理简单，操作简便易行，一经问世，便得到了广泛的应用。适配子具有亲和力高且特异性好等特点，而且易于标准化，目前正在成为一种新的诊断试剂。目前，已有研究者将凝血酶的适配子成功地固化在光纤传感器上，用以检测凝血酶，这一工作为生物战剂传感器的研制提示了新的方向。国外有利用SELEX技术筛选炭疽杆菌芽孢适配子的报道，但其使用的是高压灭菌处理后的芽孢，而且没有完成适配子特异性、亲和力以及结构与功能的考察，在这一方面还有许多工作急待进行。国内有关SELEX技术的研究起步较晚，文献报道较少。本研究工作将系统地进行炭疽杆菌芽孢适配子的研究，并基于适配子的特性，建立一种以尼龙膜为载体，炭疽芽孢适配子为检测分子来检测炭疽芽孢的方法；此外，由于许多生物战剂的单克隆抗体研制存在困难，本研究可为解决这一难题提供新的思路。我们一直期望能将SELEX这一新技术应用到微生物检测的研究工作中。适配子是一段寡核苷酸，其稳定性优于单克隆抗体，已有实验证明SELEX技术可以筛选到特异性和亲和力都强于单克隆抗体的适配子；而适配子与靶物质的结合是结构依赖性，而不是序列依赖性的，因此不需杂交等步骤；此外适配于的筛选是一种体外筛选，不涉及免疫过程，适用范困广。基于上述考虑，结合国外的技术进展和自身工作的实际需要，我们拟定了这一课题，目的不仅在于以炭疽杆菌的芽抱作为筛选模式，筛选到炭疽芽抱特异的适配子，将筛选到的适配子作结构与功能研究，并将亲和性较好的适配子作为检测炭疽芽抱的检测分子；还期望在我们实验室建立起行之有效的SELEX技术，用于单克隆抗体制备存在困难的其它生物战剂，为生物战剂的快速侦检开辟新的思路。研究结果显示：在体外构建的两端为固定序列，中I’riJ随机区域为 35个核昔酸序列，其全长为78个核昔酸的随机寡核昔酸文库的基础卜，用炭疽秆菌疫茵株 A．161｛的芽抱为靶物质，在含有 2价 Mg‘”存在的情况下，按SSDNA：炭疽芽抱＝l…g：1．5X108混合，经过了十／轮“吸附－漂洗－洗脱－扩增”的SELEX过程，同时，每三轮的筛选产物用蜡样芽抱杆菌芽抱进行反筛，以提高筛选的特异性。筛选产物经扩增后在 15％的聚丙烯酚胺凝胶电泳图中显示，随着筛选轮数的增加，PCR扩增电泳条带逐渐单纯。为了提高产物的忠实性，PCR扩增的优化条件为：采用热启动法扩增可以稳定地获得较好的扩增结果；退火温度在58OC ～68C、循环数为20～22时，有预期的扩增带。将每轮的筛选产物用标有生物素的引物PCR扩增后，与炭疽芽抱进行结合实验，TMB显色系统提示，第十八轮筛选的炭疽芽抱适配子库与芽抱结合后显色O＊值比第一轮的O＊值提高了37 fg以上，在第六轮筛选时，出现了O＊值降低，这种现象的产生是山于筛选压”（选择／进化压）的影响，使得筛选库中所期望得到的寡核昔酸片段的特异性增强。在考察筛选库的特异性时，将高压灭菌后的炭疽芽抱和筛选用炭疽芽泡约 IXIO’分别与第十八轮的筛选库巾g作结合实验，检测的0．D值分别是0．193和 1．1H，说明了筛选产物对靶物质的特异性较强。考虑到芽抱是一个多表位的靶物质，是个混合靶物质的筛选过程，筛选的适配子是多样的，我们将筛选库进行了单链和双链（加热与不加热）DNA与炭疽芽抱的结合实验。结果显示，适配子与芽抱结合以单链为主，双链也有结合。在经过了成功的十八轮SELEX筛选后，将筛选产物－寡核昔酸片段进行了克隆，在500个克隆子中随机选取79个克隆子进行了测序，将测序结果按碱基多少分为A、BVH群，AJty的54条与预期片段大小一致，一10 一少数片段在3’端固定区有个别碱基突变山群为25条大小不等的片段。可分为两个亚群，BI群为12条随机序列区域短于所期望长度的片段，并在随机区域或 3’端引物区域有碱基突变；BZ群为＊条长于预期长度的片段，主要表现在3’端引物序列的重复出现。造成短于彬］望片段长短的原因可能是山于跳跃PCR的影响；长于期望片段长度的原因PJ‘能是低温下，引物与随机区域退火延伸所致。将测序序列（适配－f）计算机分析软件分析测序序列的保守
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R346

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