幽门螺杆菌尿素酶B和黏附素A核酸疫苗的研究
发布时间：2020-08-09 15:06
【摘要】：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是革兰氏阴性的微需氧菌。在世界范围内，其人群感染率达50％以上。H. pylori为胃、十二指肠溃疡的主要病原，与胃癌、胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤密切相关，已被世界卫生组织列为与胃癌发生相关的Ⅰ类病原。目前控制H. pylori的感染主要进行H. pylori根治性治疗，主要治疗方案为联合应用质子泵抑制剂和抗生素的疗法。虽然获得较好的疗效，仍然存在下列问题：如患者对药物的依从性、抗生素耐药菌株不断出现、再感染的发生及药物的不良反应如腹痛、恶心、呕吐，这都可能使临床药物治疗受到限制，另外，药物治疗仅针对有症状的患者，而无症状的H. pylori携带者仍存在发展为慢性胃炎甚至胃癌的危险性。如何在广大人群中有效控制H. pylori感染，并遏制感染后的一系列相关疾病的发生发展具有重要意义。有效的预防性和治疗性H. pylori疫苗可以克服上述药物根治治疗H. pylori的不足之处，被认为是控制H. pylori感染的最有前景的方法。 核酸疫苗分为DNA和RNA疫苗，主要指DNA疫苗。DNA疫苗是继减毒、灭活和亚单位疫苗之后的第3代疫苗，通常由编码病原或肿瘤细胞的质粒DNA分子构成。DNA疫苗接种后，机体细胞摄取DNA，并在细胞中表达所编码的抗原。DNA疫苗作为一项新型免疫技术和传统疫苗包括灭活、减毒和亚单位疫苗相比，具有显著的优势：和大多数亚单位疫苗不同，DNA疫苗可以刺激机体同时产生体液免疫及细胞免疫，而体液免疫和细胞免疫对获得免疫预防和免疫治疗作用至关重要。虽然传统的减毒疫苗也可刺激机体同时产生体液免疫和细胞免疫，但此疫苗存在安全隐患，可能由减毒状态回复至毒性状态，而DNA疫苗则无此危险性。DNA疫苗通过基因工程技术制造，可对基因进行修饰，制作相对简单，疫苗本身为具有热稳定性的重组质粒，无需特别纯化。另外，尚有报道DNA疫苗可刺激产生长久的免疫作用。 DNA疫苗已被广泛用于动物实验和非人类的灵长类动物，可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫反应。DNA疫苗免疫逐渐成为病毒、细菌和寄生虫等病原的极具前景的治疗方法。动物实验已经证实DNA疫苗对HIV病毒、流感 第二军医大学博士学位论文中文摘要 病毒、狂犬病毒、疟疾、结核杆菌等具免疫保护作用。临床实验也显示DNA 疫苗的安全性和良好的耐受性。然而目前对H刃tori疫苗的研究还大多采用 全菌超声裂解物或单个保护性抗原蛋白疫苗和佐剂如霍乱毒素或热稳定性大 肠杆菌肠毒素，该类疫苗制作较复杂，免疫佐剂尚具较大的胃肠道毒性。 目前被广泛应用的免疫佐剂大多可刺激机体产生非特异性免疫反应，然而 由于存在的较大毒性，使其难以用于人类临床。细胞因子如IL一2、IL一4、IL一12、 IFN一Y已被证实可以调节免疫反应，一些研究证实，在疫苗接种的同时摄入细 胞因子蛋白作为佐剂，或者接种表达细胞因子的质粒可以提高或调节机体对 DNA疫苗的免疫应答，而至今，大多数研究都通过和病毒抗原或肿瘤相关抗 原疫苗共同免疫来证实细胞因子的佐剂作用，而细胞因子佐剂在H Pylori.疫 苗的免疫调节作用尚未见报道。 活的减毒细菌载体如减毒沙门氏菌系统被证实为有效的疫苗载体工具，体 外研究表明该菌可把DNA疫苗运输到人体细胞，并在体内的感染和肿瘤动物 模型被证实。减毒沙门氏菌可使疫苗通过豁膜表面接种，以勃膜相关淋巴组织 中的抗原递呈细胞为靶细胞，最终刺激产生局部和全身免疫反应，使机体获得 免疫保护。 本研究拟构建以减毒沙门氏菌为载体、UreB或HpaA为保护性抗原、IL一2 为免疫佐剂的核酸疫苗，并检测其预防性和治疗性免疫保护作用。 1构成核酸疫苗的重组质粒的构建 目的:构建编码H刃tori ureB及饰aA基因及小鼠IL一2基因的核酸疫苗 重组质粒。 方法:抽提HPylori基因组DNA，应用PCR技术分别扩增ureB及hPaA 基因片断;从重组质粒pCIneo一工L一2扩增IL一2基因，分别克隆入puCmT载 体，检测ureB、hpaA、IL一2基因序列，经过酶切、连接反应将测序后的上述 基因片断其克隆入真核表达载体PIRES，并导入感受态大肠杆菌DHS“，筛 选阳性克隆，通过PCR和酶切反应鉴定。 结果:分别扩增出约一700bp的ureB基因、75obp的hpaA和slobp的IL一2， 测序结果表明扩增出的ureB、hpaA、IL一2基因与基因库公布的序列一致，PCR 和酶切鉴定结果证实上述基因克隆入真核表达载体PIRES，成功构建了核酸疫 苗的重组质粒pIRES一ureB、PIRES一ureB一IL一2、PIRES一hPaA一IL一2。 第二军医大学 博士学位论文 中文摘要 结论:构建了编码H刃lori ureB和hPaA基因及小鼠IL一2基因的重组质 粒，为进一步探索其体内外免疫性奠定了基础。 2重组质粒体外免疫原性的检测 目的:检测重组质粒pIRES一ureB、pIRES一ureB一IL一2、pIRES一hpaA一IL一2 体外的免疫原性。 方法:采用Qiagen Plasmid Midi Kits大量抽提重组质粒pIRES一ureB、 pxREs一ureB一IL一2、pIREs一hpaA一IL一2，通过脂质体Lip。feetam一neTMZ000把重 组质粒转染体外培养的COS--7细胞，采用聚丙烯酞胺凝胶电泳和免疫印迹法检 测pIRES一ureB、pIRES一ureB一IL一2、p
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392
【图文】：
2.IPCR扩增目的基因以HPytori基因组DNA为模板，进行ureB基因扩增，产物于1一1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果可见1700bp左右的扩增产物，见图1一1;以HPytori基因组DNA为模板，进行hpaA基因扩增，结果可见75Obp左右的扩增产物，见图1一2;以pC工ne。一工L一2质粒为模板，进行PCR扩增，结果可见51Obp左右的扩增产物结果见图1一3。图1一1ureB基因PeR扩增结果Lanel:空白对照;laneZ一3:ureB扩增产物:lane4:DNAMarker(DL2000+15000)图1一2hpaA基因PCR扩增结果Lanel:DNAMarkerDL2000;laneZ，4:hpaA的扩增产物;Lane3:空白对照图1一3质粒pCIneo一IL一2的PCR扩增lanel，4:空白对照;Lane3:DNAMarker(DL2000+15000);LaneZ:质粒的IL一2的PCR扩增产物2.2PCR扩增产物测序分析结果由上海申友生物技术有限公司及上海申能博采生物技术有限公司对克隆入T载体的PCR产物进行测序
2.3.2pIRES一ureB及pIRES一ureB一IL一2重组质粒鉴定pIRES一ureB经Nhel和Xhol双酶切，可见1700bp的ureB片断和6.Ikb的pIRES片断，见图1一7;以pIRES一ureB为模板可扩增出1700bp的ureB基因片断，见图1一8;pIRES一ureB经Nhel和Notl双酶切可得5.44kb和2.36kb(包含盯eB+IRES序列)的片断，见图1一11，以上均证实重组质粒p工RES一ureB的成功构建。pIRES一ureB一IL一2经Nhel和Xhol双酶切可得1700bp的ureB片断和6.6kb的pIRES一IL一2片断，见图1一9;pIRES一ureB一IL一2PCR反应可获得1700bp的ureB产物和510bpIL一2产物，经Nhel和Xhol双酶切可得1700bp的ureB片断，而经Sall和Notl双酶切可得到510bp的IL一2片断，见图1一10。经Nhel和Notl双酶切可得5.44kb和2.87kb(含ureB+IRES+IL一2序列)片断
Lanel:vUCmT一ureB为阳性对照;LaneZ:阴性对照;Lane3一4:pIRES一ureB;Lsnes:DL2000DNAMsrker图1一9图1一10图1一9pIRES一ureB一IL一2Nhel和Xhol双酶切鉴定Lanel一2:pIRES一ureB一IL一2不同克隆双酶切鉴定图;Lane3:入一HindlllDNAMarker图1一10pIRES一ureB一IL一2双酶切和PCR鉴定Lanel:PCR阴性对照;LaneZ:pIRES质粒;Lane3:pIRES一ureB一IL一2经Nhel和XhoI双酶切;Lane4:pIRES一ureB一IL一2扩增的ureB产物;Lanes:pIRES一ureB一IL一2经撇1I和NOrl双酶切;Lane6:pIRES一ureB一IL一2扩增的IL一2产物;Lane7:DNAMarker(DL2000+15000);Lanes:PCR阴性对照图1一11pIRES一ureB一IL一2和pIRES一ureBNhel和Notl双酶切鉴定Lanel:pIRES一ureB双酶切鉴定图(5.44kb+1.7kb+660bp);LaneZ:pIRES一ureB一IL一2双酶切鉴定图(5.44kb+1.7kb+510bp+660bp);Lane3:IkbDNAMarker2.3.3pIRES一hpaA一IL一2重组质粒的鉴定pIRES一hpaA一IL一2质粒EeoRI+Mlul双酶切电泳结果如图1一12，可见
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392
【图文】：
2.IPCR扩增目的基因以HPytori基因组DNA为模板，进行ureB基因扩增，产物于1一1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果可见1700bp左右的扩增产物，见图1一1;以HPytori基因组DNA为模板，进行hpaA基因扩增，结果可见75Obp左右的扩增产物，见图1一2;以pC工ne。一工L一2质粒为模板，进行PCR扩增，结果可见51Obp左右的扩增产物结果见图1一3。图1一1ureB基因PeR扩增结果Lanel:空白对照;laneZ一3:ureB扩增产物:lane4:DNAMarker(DL2000+15000)图1一2hpaA基因PCR扩增结果Lanel:DNAMarkerDL2000;laneZ，4:hpaA的扩增产物;Lane3:空白对照图1一3质粒pCIneo一IL一2的PCR扩增lanel，4:空白对照;Lane3:DNAMarker(DL2000+15000);LaneZ:质粒的IL一2的PCR扩增产物2.2PCR扩增产物测序分析结果由上海申友生物技术有限公司及上海申能博采生物技术有限公司对克隆入T载体的PCR产物进行测序
2.3.2pIRES一ureB及pIRES一ureB一IL一2重组质粒鉴定pIRES一ureB经Nhel和Xhol双酶切，可见1700bp的ureB片断和6.Ikb的pIRES片断，见图1一7;以pIRES一ureB为模板可扩增出1700bp的ureB基因片断，见图1一8;pIRES一ureB经Nhel和Notl双酶切可得5.44kb和2.36kb(包含盯eB+IRES序列)的片断，见图1一11，以上均证实重组质粒p工RES一ureB的成功构建。pIRES一ureB一IL一2经Nhel和Xhol双酶切可得1700bp的ureB片断和6.6kb的pIRES一IL一2片断，见图1一9;pIRES一ureB一IL一2PCR反应可获得1700bp的ureB产物和510bpIL一2产物，经Nhel和Xhol双酶切可得1700bp的ureB片断，而经Sall和Notl双酶切可得到510bp的IL一2片断，见图1一10。经Nhel和Notl双酶切可得5.44kb和2.87kb(含ureB+IRES+IL一2序列)片断
Lanel:vUCmT一ureB为阳性对照;LaneZ:阴性对照;Lane3一4:pIRES一ureB;Lsnes:DL2000DNAMsrker图1一9图1一10图1一9pIRES一ureB一IL一2Nhel和Xhol双酶切鉴定Lanel一2:pIRES一ureB一IL一2不同克隆双酶切鉴定图;Lane3:入一HindlllDNAMarker图1一10pIRES一ureB一IL一2双酶切和PCR鉴定Lanel:PCR阴性对照;LaneZ:pIRES质粒;Lane3:pIRES一ureB一IL一2经Nhel和XhoI双酶切;Lane4:pIRES一ureB一IL一2扩增的ureB产物;Lanes:pIRES一ureB一IL一2经撇1I和NOrl双酶切;Lane6:pIRES一ureB一IL一2扩增的IL一2产物;Lane7:DNAMarker(DL2000+15000);Lanes:PCR阴性对照图1一11pIRES一ureB一IL一2和pIRES一ureBNhel和Notl双酶切鉴定Lanel:pIRES一ureB双酶切鉴定图(5.44kb+1.7kb+660bp);LaneZ:pIRES一ureB一IL一2双酶切鉴定图(5.44kb+1.7kb+510bp+660bp);Lane3:IkbDNAMarker2.3.3pIRES一hpaA一IL一2重组质粒的鉴定pIRES一hpaA一IL一2质粒EeoRI+Mlul双酶切电泳结果如图1一12，可见
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 向淑利;DNA疫苗与脂质体[J];现代医药卫生;2001年07期
2 朱森林,陈e
本文编号：2787286
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shiyanyixue/2787286.html
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