抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞表型分析的新方法

发布时间：2020-08-09 19:15

【摘要】：T淋巴细胞在免疫反应中起着重要的作用，其中之一是细胞毒性反应，即T淋巴细胞通过裂解作用杀伤表达特异性抗原的异常细胞。具有这种细胞毒性作用的T细胞的表面抗原大部分是CD_8阳性，被称为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)。CTLs能够清除机体内病毒、细菌和寄生虫感染的细胞，杀伤肿瘤细胞，也能在同种异体移植免疫反应过程中起排斥作用。CTLs识别抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)表面的MHC I类分子与抗原肽形成的复合体，目前已知与MHC I类分子结合的抗原肽无论来自肿瘤抗原或其它外源病原微生物抗原都是含8-11氨基酸的短肽，该短肽与MHC I类分子非共价结合，位于抗原递呈细胞的表面，被CTLs表面的T细胞受体(T-cell receptor，TCR)识别而诱导产生CTL反应。抗原特异性CTLs的定量或定性检测无论对临床诊断、疫苗免疫或免疫抑制治疗后进行的疗效评估都是至关重要的手段。 许多实验室通过对TCR及其配体的研究发现它们之间的相互作用很弱(10~(-4)～10~(-7)M)，且解离速度很快，半衰期只有几秒钟，使得CTLs的检测非常困难。目前体外检测抗原特异性CTL反应的方法主要有以下4种：(1)~(51)Cr释放分析法；(2)检测CTLs分泌的细胞因子法；(3)针对特异性TCR的PCR法：(4)利用可结合于TCR的荧光抗原标记CTLs的可溶性MHC-肽四聚体分析法。由于前两种方法需要在体外进行细胞增殖培养，可因多种因素造成CTLs的检测结果偏低，且检测步骤复杂，临床实用性差；第三种方法基于PCR技术，其敏感性高，但是仅仅局限于已知TCR基因型的特异性CTLs的检测：最后一种四聚体分析法于近年来兴起，已被较广泛地应用，是直接检测抗原特异性CTLs的方法，该方法用四价MHC-肽复合物减慢了其与TCR的解离率，同时利用流式细胞仪技术大大增强了敏感性，但是仍然没有从根本上克服解离率快这一限制CTLs检测方法发展的关键问题。 在本研究中，我们设计了新的直接检测人外周血抗原特异性CTLs的方法，
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R392
【图文】：

部分cDNA序列)和326bp分别用%l的琼脂糖凝胶电泳(图8)和1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析(图9)。把上述PCR的纯化产物连接到pGEM一TEASY载体上送测序;测序结果与从GENEBANK获得的HLA一A*0201和pZmcNDA序列进行比较，本实验获得的GNEEBANK中HLA一A*0201序列完全一致，HLA一A*0201部分cDNA序列与pZmeDNA序列的第75位碱基C突变为t，考虑可能是由于密码子的第三个碱基(tg旦响翻译结果。CPR过程中引入的突变，但是，该突变恰巧是三连，tg上)，是同义突变，其编码的氨基酸相同，不影

上述两种PCR产物经过纯化后，可以进行退火和延伸，再加入外侧上、下游引物进行再扩增，获得了86b4p大小的HLA一A*0201E58C突变cDNA序列，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析(图13)，然后克隆在pGEM一TEASY载体上，送测序，测序结果与GENEBANK中的HLA一A*O20lcDNA序列相互比较，

突变引物c和HLA一A*0201外侧下游引物d扩增HLA一A*0201第55一第271位氨基酸的cDNA序列，分别得到202Pb和683Pb大小的两种PCR产物，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析(图12);由于中央突变引物之间存在着互补序列，上述两种PCR产物经过纯化后，可以进行退火和延伸，再加入外侧上、下游引物进行再扩增，获得了86b4p大小的HLA一A*0201E58C突变cDNA序列，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析(图13)，然后克隆在pGEM一TEASY载体上，送测序，测序结果与GENEBANK中的HLA一A*O20lcDNA序列相互比较，

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

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本文编号：2787437