【摘要】：研究背景： 学习和记忆是脑的高级功能。深入研究学习和记忆的机理,对于开发脑的功能,治疗与学习记忆障碍有关的疾病等具有重要的意义。杏仁核是边缘系统的重要结构之一,与学习记忆、情绪、情感密切相关,而且参与精神分裂症、抑郁、癫痫和创伤后应激障碍等多种神经系统疾病的病理过程。杏仁核是条件性恐惧记忆形成和储存的部位,条件性恐惧记忆是由条件刺激和非条件刺激配对训练而形成的。 重组激活基因-1(recombination activating gene-1, RAG1)最早在免疫系统中发现,并且与免疫细胞特异性的记忆活动密切相关。它编码的产物与其他相关蛋白协同作用,能够引起V(D)J重排,使得免疫球蛋白和T细胞受体产生高度多样性。既往国外报道了RAG1基因敲除后可以导致动物的免疫记忆功能缺失,引起重度联合免疫缺陷疾病。后来的研究发现,中枢神经系统中有RAG1的转录,并且表达的部位主要集中于海马、边缘系统等与学习记忆有关的脑区,然而RAG1是否与学习和记忆功能有关目前尚未明确。 大脑和免疫系统都具有编码记忆的能力,研究资料也表明脑内存在着与免疫系统中相类似的基因重组。为了明确脑内RAG1基因的缺失是否会影响学习记忆功能,通过对RAG1敲除小鼠进行研究发现,RAG1缺失会引起小鼠神经行为的改变。然而,用基因敲除技术来研究RAG1在中枢神经系统中的功能存在着不足之处,因为动物从胚胎期就开始缺失RAG1基因会造成免疫缺陷,对其发育过程会产生干扰,从而对后续实验的结果造成影响。 因此本工作采用RNA干扰技术,避开基因敲除技术的弊端,对杏仁核区RAG1的表达进行了基因沉默,比较研究RAG1基因沉默前后大鼠学习和记忆能力的变化。 第一部分条件性恐惧训练对大鼠杏仁核内RAG1表达的影响 目的： 检测条件恐惧训练后大鼠杏仁核区RAG1的表达变化。 方法与结果： 大鼠随机分为对照组和条件性恐惧实验组,建立条件恐惧记忆模型,并以呆立时间(freezing time)评价大鼠对条件恐惧事件的记忆。条件恐惧刺激后30min、1h,应用荧光定量PCR对大鼠杏仁核区RAG1的表达量进行检测。结果显示：实验组大鼠在被重新放入电击箱后,5min内的呆立时间明显长于相应时间点的对照组,差异具有统计学意义。与对照组相比,实验组杏仁核内RAG1的表达量明显增加。结论： 条件性恐惧训练会引起大鼠杏仁核区RAG1表达水平增高。 第二部分大鼠RAG1基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定 目的： 构建有效的慢病毒载体,并观察其对RAG1表达的抑制效应。 方法与结果： 设计针对RAG1基因的最优shRNA序列及1对无关序列,经单链片段的合成和退火后,分别克隆至pMagic4.1载体的酶切位点处,经酶切、测序鉴定正确后,将重组质粒与包膜质粒pMD2G、包装质粒pMDlg/pRRE及REV表达质粒pRSV-Rev共转染293T细胞,包装成慢病毒。Real-time PCR方法测定病毒滴度,感染体外培养的大鼠神经元后,通过免疫印迹和Real-time PCR检测RAG1的表达水平。测定LV-shRNA病毒的滴度为2.08×108TU/ml,对照病毒(LV-Negative)的滴度为1.79×109TU/ml。与未感染慢病毒组相比较,慢病毒感染神经元后,RAG1的表达水平受到明显的抑制。 结论： 根据RAG1基因序列利用siRNA target finder软件设计出特异性的shRNA序列。成功构建了慢病毒载体,该载体能有效感染大鼠原代神经元并抑制RAG1的表达。 第三部分RNA干扰下调杏仁核RAG1表达对大鼠恐惧记忆的影响 目的： 观察RAG1被抑制后是否会影响到恐惧记忆能力,以及随后观察杏仁核神经元是否有相应的形态学改变。 方法与结果： SD大鼠随机分为三组：分别为正常对照组,注射干扰病毒组(LV-shRNA),注射对照病毒组(LV-Negative).通过脑立体定位仪将慢病毒载体注射到大鼠双侧杏仁核。注射病毒一周后利用RT-PCR检测慢病毒干扰RAG1mRNA表达的效果,并切片观察注射区GFP表达情况。慢病毒注射入杏仁核后,RT-PCR结果显示RAG1mRNA水平明显受到抑制。注射慢病毒一周后,不同批次大鼠分别进行行为学测试。Morris水迷宫实验观察指标为逃避潜伏期和穿台次数,结果显示注射干扰病毒组与对照组以及注射对照病毒组相比没有显著性差异。利用单次被动回避反应测定大鼠的记忆能力,大鼠停留在明室的时间即反应潜时,越长代表大鼠记忆能力越佳。结果显示,在训练阶段三组动物的反应潜时没有显著性差异,在测试阶段,LV-shRNA组的反应潜时与对照组、LV-Negative组相比明显减少。条件性恐惧结果显示,LV-shRNA组的呆立时间与对照组、LV-Negative组相比明显减少。各组大鼠在条件性恐惧观察结束后立即处死,取杏仁核组织制作电镜包埋和切片,电镜观察结果显示LV-shRNA组杏仁核区单位面积突触数目明显少于正常组大鼠。 结论： 慢病毒载体注射到杏仁核后,能够引起RAG1mRNA表达水平的显著性降低。杏仁核内RAG1的表达抑制能够造成大鼠恐惧记忆能力降低。杏仁核内RAG1的表达抑制后其突触数量较正常组减少。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R338
【共引文献】
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