PEA3在肾小管上皮细胞间充质转分化中的作用及机制研究

发布时间：2020-08-12 17:09

【摘要】：随着社会经济的发展和人们生活方式的改变，人类疾病谱正在发生变化，慢性肾脏病（CKD)已呈现流行特征。CKD具有患病率高、医疗费用巨大、易合并心血管疾病而导致病死率和致残率高等特点，目前已成为影响我国国民健康的主要疾病[1]。肾小管间质纤维化是各种原因引起的CKD发展到终末期肾衰竭的共同归路。近年来研宄表明，肾小管间质损伤的严重程度是影响CKD预后的决定因素[2]。因此，如何早期预防和减轻肾小管间质的损伤，是延缓CKD的慢性进展、减轻或消除肾脏纤维化的关键所在，也是肾脏疾病防治战略中最重要的步骤之一。业已证实，上皮细胞和间充质细胞之间可相互转变M。在肾脏胚胎发育期，间充质细胞可转变为上皮细胞，即MET (mesenchymal-epithelialtransition),形成由上皮细胞组成的管样结构，最终逐渐分化并形成肾小管和肾小球；而在成年期，肾小管上皮细胞受到损伤因素刺激后可发生表型转变，由上皮细胞转分化为间充质细胞，造成肾小管间质损伤，最终发展为肾小管间质纤维化。对肾小管间质纤维化的研宄发现，超过1/3的间质成纤维细胞来源于局部肾小管上皮细胞发生的EMT[4]，因此，EMT是导致肾小管间质纤维化的中心环节之一[5’6]。本研宄小组前期应用抑制性差减杂交技术构建新生大鼠和生后21天大鼠肾脏发育差减文库，发现多个拷贝的PEA3基因。PEA3属于Ets癌基因家族成员，其编码蛋白C端含有一个非常保守的Ets结构域，该结构域同时也是DNA结合域。Ets家族蛋白具有调控多种基因表达的作用，包括调控生长、转录、T细胞活化和器官发育等。PEA3主要表达于那些需经历上皮一基质相互诱导发育的组织器官，参与其发育过程[7]。课题组前期研宄发现，PEA3在胚胎肾发育中显著高表达，其通过诱导WH表达进而促进间充质细胞向正常肾组织结构转化，诱导MET，形成由上皮细胞组成的管样结构，最终逐渐分化并形成肾小管和肾小球，该作用与BMP-7在胚胎发育中的作用相似。业已证实，BMP-7可通过阻断肾小管上皮细胞转分化而减轻和延缓肾脏纤维化，且通过TESS启动子分析软件发现BMP-7启动子区有两个PEA3结合位点，因此，我们推测PEA3可能通过上调BMP-7阻断EMT。除此之外，已有文献报道，TGF-f31可以诱导肾小管上皮细胞ROS释放增多，ROS继而增强smad2磷酸化最终加剧EMT的发生[8]。本研宄小组亦发现线粒体功能障碍可以加剧醛固酮诱导的人肾小管上皮细胞EMT，并验证了PGC-1a过表达可以阻断线粒体功能障碍进而抑制EMT。这些为探讨EMT的发生机制及干预靶点提供了新的视野。PGC-1a在阻断线粒体功能障碍中发挥极其重要的作用，其最主要的生物学功能是刺激线粒体的生物合成以及增强线粒体的代谢能力，通过刺激线粒体转录因子A (TFAM)的表达调节mtDNA的合成；通过对线粒体核呼吸因子的调节来调节线粒体氧化磷酸化过程，促进ATP的合成；通过激活经典抗氧化酶、UCPs等多条抗氧化防御系统来阻止ROS引起的损伤。于是，我们设想PEA3是否可以通过上调PGC-1a发挥阻断EMT的作用。 PEA3在肾小管上皮细胞转分化和肾小管间质纤维化中的作用尚不清楚，因此本研宄拟通过对实验性肾脏病动物模型的观察及体外肾小管上皮细胞培养，探讨PEA3在肾小管间质纤维化中的作用及其机制，并对其进行相关干预实验。全反式维甲酸（ATRA)是维生素A的活性代谢产物，在胚胎及成年组织中有多种生物学活性，如在细胞增生、凋亡、分化、生殖、维持细胞正常功能、免疫调节等方面发挥重要作用。近年来全反式维甲酸在肾脏疾病中的作用受到国外学者的关注。多项研宄结果证实，ATRA具有改善肾小球肥大，延缓肾脏纤维化，保护肾功能的作用。但ATRA对于肾脏纤维化的影响尚缺乏深入研宄。已有文献发现全反式维甲酸能够在转录水平上上调BMP-7的表达，促进内源性BMP-7增多，进一步通过与受体结合等多种途径发挥保护肾脏的作用，有效地延缓了糖尿病肾脏纤维化进程。因此，本研宄试图观察ATRA对肾小管上皮细胞间充质转分化的作用并探讨其具体作用机制。第一部分：PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达目的观察PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达方法建立如下实验性肾脏病动物模型：顺铂模型、庆大霉素模型、醛固酉同模型、阿霉素肾病模型及UUO动物模型，采用Real-time PCR、western blot及免疫组化的方法，检测PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达变化。结果Real-time PCR、western blot结果显不：UUO模型组较正常小鼠组PEA3表达明显增加；免疫组化结果显示：UU0模型组第七天PEA3表达明显增加，第14天达到高峰，主要表达于肾小球和肾间质细胞，少量表达于肾小管；庆大霉素组PEA3较正常组表达明显升高，于第5天达到高峰，之后逐渐下降，主要表达于损伤的肾小管；阿霉素组较正常组PEA3表达显著增加，主要表达于肾小管；醛固酮模型组从第三天开始肾小球中可见少量PEA3表达，之后逐渐增加，多表达于肾小管和肾小球；顺铂模型(20mg/kg)组较正常组PEA3表达升高，主要见于肾小管。结论随着实验性肾脏病动物模型肾脏纤维化程度加重，PEA3表达逐渐增加，提示该基因可能在肾脏纤维化过程中发挥一定作用；且其表达多见于肾小管及肾小球，提示其可能参与肾小管上皮细胞一间充质细胞转分化的过程。第二部分：PEA3在肾小管上皮细胞一间充质转分化中的作用及机制研究目的本研宄旨在从实验性肾脏病动物模型中观察到的现象探讨PEA3在肾小管上皮细胞一间充质转分化过程中的作用及其可能的机制。方法（1)构建PEA3真核表达载体，转染人肾小管上皮细胞（HK-2)，应用Real-time PCR和Western Blot技术观察该细胞中PEA3和BMP_7mRNA和蛋白表达；（2)过表达PEA3的HK-2细胞，应用TGFβ-1(5ng/ml)刺激或应用BMP-7siRNA预处理后再加入TGFβ-1刺激，Real-time PCR和Western Blot检测Smad-1，2，3，5，8和a-SMA、 CTGF、 Collagen I (Coll)、 E-cadherin、ZO-1表达；（3)采用RNAi技术，构建PEA3siRNA，转染体外培养的HK_2细胞以抑制PEA3表达，再加入TGFβ-1刺激，应用Real-time PCR和Western Blot检测PEA3及BMP-7mRNA和蛋白表达、Smad-1,2，3，5，8和a-SMA、CTGF、Coll、E-cadherin、ZO-1表达；(4)体外培养HK-2细胞，应用TGF-^1刺激检测不同时间点线粒体功能障碍的损伤程度；（5)共转染PEA3和PGC-1α siRNA至HK-2细胞，加入TGFβ-1刺激，应用荧光探针2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸（DCFDA)检测细胞内活性氧(R0S)的变化；JC-1检测线粒体膜电位；Real-timePCR检测线粒体DNA拷贝数；Real-timePCR和Western Blot检测PEA3、PGC1_a、TFAM、E-cadherin、Vimentin、ILK禾口a-SMA的表达情况。结果（1) Real-time PCR和Western Blot结果显示：PEA3过表达组PEA3mRNA和蛋白表达明显升高，且PEA3过表达可上调BMP-7mRNA和蛋白表达；（2)HK-2细胞加入TGFβ-1刺激后，a-SMA, CTGF和Coll表达及smad2/3磷酸化显著增加，而E-cadherin和Z0-1表达以及smadl/5/8磷酸化降低；PEA3过表达后显著抑制TGFβ-1诱导的a-SMA, CTGF和Coll表达及smad2/3磷酸化，并上调E-cadherin和Z0-1表达及smadl/5/8磷酸化；共转染PEA3和BMP_7siRNA的HK-2细胞加入TGFβ-1刺激，BMP-7siRNA显著降低了PEA3对TGFβ-1的保护作用；(3)HK-2细胞转染PEA3siRNA后，PEA3表达显著下降，其抑制率达50%。PEA3siRNA转染组BMP-7mRNA和蛋白表达均显著降低，该组再加入TGFβ-1刺激，较未加入PEA3siRNA预处理组，a-SMA、CTGF、Coll、smad2/3磷酸化增加，E-cadherin, ZO-1、smadl/5/8磷酸化减少;(4) TGFβ-1可诱导HK-2细胞发生线粒体功能障碍；（5) PEA3过表达可上调PGC-1α和TFAM表达，并缓解TGF-β-1诱导的线粒体功能障碍；转染PGC-1α siRNA后减弱了PEA3对TGFβ-1诱导的线粒体功能障碍和EMT的保护作用。结论PEA3可通过上调BMP-7表达而部分阻断TGFβ-1诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化；PEA3可通过上调PGC-1α缓解TGFβ-1诱导的肾小管上皮细胞线粒体功能障碍进而部分阻断TGF-1诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化。第三部分：PEA3在全反式维甲酸阻断肾小管上皮细胞一间充质转分化中的作用目的探讨全反式维甲酸对肾小管上皮细胞间充质转分化的影响及机制研宄，并观察PEA3在该过程中发挥的作用。方法（1)体外培养HK-2细胞，应用ATRA预处理30分钟后再加入TGF-旦1刺激48h，应用Real-time PCR禾口Western Blot检测EMT相关分子E_cad-herin、ZO-1、a-SMA、Coll和CTGFmRNA和蛋白表达;(2)予UUO小鼠ATRA处理，Real-time PCR和Western Blot检测TGF-、E-cadherin、ZO-1、a-SMA、Coll和CTGF mRNA和蛋白表达；(3)体外培养HK-2细胞，构建BMP-7启动子和虫荧光素酶报告基因重组质粒，转入HK-2细胞，加入ATRA刺激后，应用虫荧光素酶活性检测法检测BMP-7启动子的活性，Real-time PCR和Western Blot检测BMP-7表达，Western Blot检测Smadl/5/8磷酸化；(4) HK-2细胞转染BMP-7siRNA后再加入ATRA和TGFβ-1处理，应用Real-time PCR和Western Blot检测E-cadherin、ZO-1、a-SMA、Coll和CTGF mRNA和蛋白表达;(5)将BMP-7启动子和虫荧光素酶报告基因重组质粒转染至HK-2细胞，分别过表达和干扰RARa和RXRa基因，加入ATRA刺激细胞24h，检测荧光素酶活性；（6)应用Western Blot检测不同剂量ATRA刺激细胞后PEA3的表达变化，如上调，再应用Chip检测ATRA与PEA3的结合情况；将BMP-7启动子和虫荧光素酶报告基因重组质粒转染至HK-2细胞，分别过表达和干扰PEA3，加入ATRA刺激细胞24h，检测荧光素酶活性；（7)应用Chip检测RARa与PEA3结合情况，分别转染RARa质粒、RXRa质粒、PEA3siRNA后，加入ATRA刺激，检测BMP-7荧光素酶活性。结果（l)ATRA明显呈剂量依赖性地抑制TGFβ-1诱导的EMT，即抑制TGF-β-1诱导的a-SMA、Coll和CTGF表达而上调E-cadherin和Z0-1表达；（2)Real-time PCR和Western Blot研宄结果表明，UU0小鼠肾组织中TGF-e、a-SMA,ColI和CTGF表达显著上调，而E-cadherin和Z0_1表达则显著下降，ATRA处理后明显抑制UU0的纤维化；（3) ATRA呈剂量依赖性上调BMP-7启动子活性，促进BMP-7mRNA和蛋白表达，同时我们还发现，ATRA显著促进了Smadl/5/8磷酸化，提示ATRA可活化BMP-7/smadl，5，8信号通路。（4) BMP_7siRNA阻断ATRA对EMT的抑制作用，BMP-7siRNA促进了a-SMA, Coll和CTGF表达而抑制E-cadherin和Z0-1表达。(5)过表达RAR a和RXR a后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性增加，且RARa和RXRa共过表达组，增加最明显，反之，RARa和RXRa干扰后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性降低，且RAR a和RXRa共干扰组，降低最明显；（6)过表达PEA3后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性增加，反之，干扰PEA3后加入ATRA刺激，BMP-7荧光素酶活性降低；（7)ATRA受体RAR a可与PEA3直接结合，且RAR a、RXR a与PEA3可共同作用于ATRA诱导BMP-7表达的过程。结论体内及体外实验均提示ATRA可以阻断肾小管上皮细胞间充质转分化，且可能通过PEA3/BMP-7/smadl，5，8信号途径发挥保护作用。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

【参考文献】