生长因子progranulin在骨修复，皮肤炎症以及椎间盘退变过程中的作用与机制研究

发布时间：2020-08-12 15:05

【摘要】：[研究背景] 大面积骨缺损的治疗一直是一个困扰临床医生的技术难题。除骨移植外,生长因子,生物材料及相关干细胞研究的组织工程学为治疗大面积骨缺损提供了新的治疗思路。生长因子progranulin (PGRN)是一种多功能蛋白,已经有研究证明PGRN在发育过程中可以促进软骨细胞分化及软骨内成骨。我们知道在骨修复过程中软骨形成软骨痂后成骨,对修复缺损起到非常关键的作用。且近期发现,PGRN通过与肿瘤坏死因子TNF-α的受体TNFR1/2相结合,保护了免疫性关节炎中骨组织不受侵蚀。生长因子PGRN促软骨细胞分化,抑破骨的作用引起我们浓厚兴趣,是否可将PGRN引入治疗大而积骨缺损呢?直至目前,PGRN在骨修复过程中所起作用及其可能涉及的相关机制尚无报道。 [实验方法] 在本实验中,我们使用多种转基因小鼠,包括野生型小鼠,PGRN基因缺失小鼠, TNFR1基因缺失小鼠,TNFR2基因缺失小鼠,’TNF-α转基因小鼠并应用多种手术诱导模型包括桡骨节段性骨缺损模型,股骨钻孔骨缺损模型,肌肉内异位骨生成模型和股骨节段性骨缺损模型研究PGRN在骨修复过程中的作用和相关机制。 [实验结果] 通过本实验,我们发现手术诱导的骨缺损模型中,PGRN基因缺失型小鼠出现骨修复过程迟缓,主要表现为节段性骨缺损模型建立后,在各个检测时间点的骨断端问距较野生型对照组明显增大,提示新骨形成缓慢,而局部使用PGRN重组蛋白可加速野生型小鼠节段性骨缺损的骨修复过程。除此之外,我们发现PGRN在BMP-2(骨形态发生蛋白-2)诱导的骨生成过程中起到不可或缺的作用,因为PGRN基因缺失型小鼠中BMP-2诱导的异位骨生成较野生型小鼠显著减少,且软骨内成骨过程明显减缓,而在PGRN基因缺失型小鼠中使用PGRN重组蛋白治疗后可以改善基因缺失导致的BMP-2异位成骨诱导不良现象。另外,我们发现PGRN介导的促骨修复作用与TNFR2密切相关。CT等影像学结果显示,在TNFR2基因缺失型小鼠中,上述PGRN促骨修复作用几乎完全消失。同时我们发现,BMP-2介导的异位骨形成在TNF-α转基因小鼠中被明显抑制。组织学分析发现在TNF-α转基因小鼠中,新生骨的边缘部分破骨细胞异常活跃,提示TNF-α的过量表达导致了新生骨侵蚀加剧,最终使新生骨量减生。我们将PGRN重组蛋白与BMP-2同时作用于TNF-α转基因小鼠,结果发现这种成骨减少现象明显改善,组织学分析发现PGRN的治疗使TNF-α转基因小鼠中破骨细胞活性降低,这提示了PGRN在骨修复过程中也可能是通过抑制炎性反应及过度活跃的破骨细胞活性起作用的 [结论] 本实验通过使用多种转基因小鼠及数种手术诱导模型,验证了PGRN在骨修复过程中起到促软骨细胞分化,抑破骨的作用。机制方面的研究显示,这种作用是通过与BMP-2及TNF-α/TNFR通路相互作用来实现的,这也提示我们PGRN有可能成为治疗骨缺损的新分子,尤其在患者处于炎性状态时发挥其独特作用。 [研究背景] 皮肤炎性疾病,包括银屑病等,属于免疫炎性疾病的一类,困扰着大量患者。但到目前为止,其发病机制及治疗措施仍然有待进一步研究。在多种皮肤炎症的发病过程中,最重要的细胞因子之一是肿瘤坏死因子(TNF-α),起到非常关键的作用。TNF-a可以通过激活相关炎性通路如NF-κB信号通路从而促进下游因子表达,继而导致炎症发生。因此,对TNF-α的拮抗就成为非常有前景的治疗方法之一。到目前为止,已经有数种针对TNF-α的药物应用于临床,并在类风湿关节炎,银屑病以及溃疡性结肠病等疾病中发挥治疗作用。然而,目前所开发的抗TNF-α药物应用于自身免疫性疾病患者后,仍有约半数患者对这些治疗药物反应不敏感或无效。因此,进一步开发新的TNF-α相关抑制剂对于治疗这些患者来说是十分必要的。Progranulin (PGRN)是一种多功能蛋白,在诸多生理及病理过程中发挥重要作用。PGRN以及其衍生工程蛋白Atsttrin已被报道可以通过与TNF-α的细胞表面受体TNFR1/2相互结合拮抗TNF-a所导致的NF-κB信号通路激活和炎性作用,并在小鼠模型中对抗免疫性关节炎(Tang, W.,等,Science,2011)。PGRN及Atsttrin的拮抗机制与前期药品不同,因为前期应用于临床的TNF-α抑制剂主要包括TNF-α的抗体或TNF-α受体类似物,通过捕获TNF-α,封闭其结合位点,从而防止其与细胞表面受体TNFR1/2相结合来实现对TNF-α功能的抑制,而PGRN及Atsttrin则通过与TNF-α受体竞争性结合起到抗炎作用。直至目前,PGRN在皮肤炎症中的作用尚无人报道。因此,在本课题中,我们使用相关实验,研究PGRN及Atsttrin在皮肤炎症中的作用及相关机制。 [实验方法] 1. PGRN在人和小鼠正常皮肤组织中的表达由免疫组化,实时荧光定量PCR及Western蛋白印迹实验检测。 2.在野生型小鼠和PGRN基因缺失型小鼠中诱导oxazolone皮肤炎症模型,通过组织学,qPCR, WB以及流式细胞技术等方法,对比野生型小鼠和PGRN从因缺失型小鼠中皮肤炎症的发生发展情况及使用Atsttrin治疗后皮肤炎症的差别。 3.在各个实验小组中对NF-κB信号通路的指标进行检测。 [实验结果] 1.兔疫组化示,PGRN在人和小鼠皮肤中均有表达。qPCR及WB发现PGRN在皮肤炎性疾病中表达上升。 2. Oxazolone诱导的皮炎模型中,较之野生型小鼠,PGRN基因缺失小鼠的皮炎程度加重,表现在诱导后鼠耳外观肿胀,厚度增加,同时qPCR示炎性反应的相关标志性分子包括包括白细胞介素1(IL-1β),白细胞介素6(IL-6),环氧化酶2(COX-2)以及诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)表达增多。另外,流式细胞学检测结果示在PGRN基因缺失小鼠颈部引流淋巴结中,其调节性T细胞的比例较野生型明显降低,使用PGRN衍生的工程蛋白Atsttrin治疗后,在野生型小鼠中,Oxazolone诱导的皮炎得以明显控制,包括诱导后耳厚度增加程度,即耳肿胀程度得以控制；组织学发现表皮组织因皮炎所致的增生程度降低,而炎性相关的标志性分子如白细胞介素1(IL-1β),白细胞介素6(IL-6),环氧化酶2(COX-2)以及诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)水平也相较于PBS对照治疗组显著性下降。 3.我们发现PGRN及Atsttrin在皮肤炎症中的保护性作用可能通过调节NF-κB信号通路的活性来实现的。在Oxazolone诱导的皮炎模型中,PGRN基因缺失小鼠局部皮肤中NF-κB信号通路组成部分NF-κB2的表达上升,而NF-κB通路抑制分子IκB的磷酸化加强,反映NF-κB通路活性增强。同时,在野生型皮炎模型中使用Atsttrin治疗后,皮炎中增强的NF-κB信号通路活性得以有效控制。 [结论] 我们研究发现皮肤炎症中PGRN表达上调。构建动物模型证明PGRN缺失致使皮炎程度加剧,Atsttrin治疗后可减轻皮炎程度。并进一步探究了参与此过程的NF-κB信号通路的活性变化。这一研究不但首次观察了内源性PGRN在皮肤炎症中的作用,也提示其衍生工程蛋白Atsttrin可能作为一种治疗炎性皮肤疾病的新型药物,应用于未来临床之中。 [研究背景] 椎间盘退行性变是发病率最高的退行性疾病之一,由多种因素引起。其特征为椎间盘在形态学和生物力学方面发生显著性变化,体现在新骨形成,软骨破坏和破骨活跃,并最终导致椎间盘结构紊乱,活动受限,且可出现下腰痛症状。在这一退变过程中所涉及的相关分子机制尚不明确,目前尚无有效控制或逆转的治疗措施。Progranulin (PGRN)作为一种多功能生长因子,与神经及关节软骨退变性疾病有密切关系。近期,有研究发现PGRN可以竞争性结合肿瘤坏死因子TNF-α的受体TNFR1/2,抑制免疫性关节炎模型中NF-κB信号通路的激活,从而保护关节软骨不受破坏。另有报道称在神经系统中,PGRN的缺失可导致wnt/β-catenin信号通路激活。而NF-κB和wnt/β-catenin通路与椎间盘退变关系密切。然而,PGRN在椎间盘退变过程中的作用尚无相关报道；是否通过上述两条通路发挥作用有待进一步求证。此实验主要研究正常以及退变状态下PGRN在椎间盘组织的表达情况,探索PGRN在椎间盘老化退变过程中的作用,并阐述相关分子机制。 [实验方法] 1.本实验采用免疫组化(IHC),实时荧光定量PCR (qPCR)以及Western免疫蛋白印迹实验技术(WB)检测人与小鼠椎间盘中PGRN的表达情况。 2.对4月龄,6月龄及9月龄的野生型和PGRN基因缺失型小鼠椎间盘进行HE染色分析一般形态学变化；Safranin O染色分析软骨成分变化；IHC检测椎间盘基质aggrecan的降解产物；破骨细胞活性由TRAP染色检测。另外进行影像学CT检测。qPCR检测椎间盘退变标志性基因的mRNA水平,包括碱性磷酸酶(ALP)骨钙素(osteocalcin),金属蛋白酶13(MMP13),10型胶原,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及织蛋白酶K (Cathepsin K) 3.野生型和PGRN基因缺失型小鼠椎间盘组织中NF-κB和wnt/β-catenin信号通路的表达与活性也通过qPCR, WB及兔疫组化实验方法进行检测。 [实验结果] 1.免疫组化实验结果显示PGRN在人和小鼠的椎间盘中均有表达,qPCR以及WB结果证实PGRN水平随老化过程而升高。 2.通过比较不同年龄组野生型和PGRN基因缺失型小鼠椎间盘白发性退变过程,发现PGRN基因缺失型小鼠椎间盘组织终板出现骨赘形成,而相邻椎体内松质骨出现骨质疏松情况。Safranin O染色及aggrecan降解产物的免疫组化结果显示PGRN基因缺失时椎间盘组织中软骨结构破坏显明加重,退变临床评分明显高于野生型对照组。另外,与同年龄野生型小鼠相比,qPCR示PGRN基因缺失型小鼠椎间盘组织中的软骨退变相关于指标水平显著性上升。 3.在实验中发现PGRN基因缺失导致椎间盘组织中NF-κB和wnt/β-catenin信号通路相关组分表达升高,活性增强,分析退变加速可能是由过度激活此二种信号通路所致。 [结论] PGRN在维持椎间盘组织稳态中起到非常重要的作用,PGRN基因缺失导致椎间盘退变加速。这为防治椎间盘退变性疾病提供了新的潜在作用靶点。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

【共引文献】