志贺氏菌和大肠杆菌O抗原基因簇的遗传进化及重要O抗原结构的研究

发布时间：2020-08-15 20:46

【摘要】：脂多糖是革兰氏阴性细菌主要的表面成分，由内到外包括类脂A、核心多糖和O-抗原。O-抗原是细菌细胞最主要的表面抗原，为由重复的寡糖单位组成的多聚糖，每一种细菌都有种类不同的O-抗原存在，形成了自然界中最为突出的生物多样性，编码合成这些多糖的酶的基因簇成为在DNA水平上研究分子进化的最好的材料。O-抗原的多样性对细菌在人或动物体中的生存有极其重要的作用，同时也是在漫长的进化过程中压力选择的结果。通过对其多样性产生的遗传基础和进化的研究可以揭示致病菌的进化和形成机理。在世界上首次对有特殊进化地位的鲍氏志贺氏菌13型O-抗原的遗传、结构和进化进行全面的研究。研究结果表明它的O-抗原的主链上有罕见的糖磷酸键，具有酸不稳定性。第一个基因的上游的残余的IS的存在和3′端部分序列的较高的相似性暗示至少它的部分序列起源于霍乱弧菌O37，也与大肠杆菌O163的亲缘关系近。通过对大肠杆菌O52 O-抗原的遗传和结构的研究发现，它是一个依赖于ABC-2转运子合成的由异源双糖组成的O-抗原，而且合成它的基因簇定位于galF和gnd基因之间。这在世界上属于首次发现。我们又通过缺失和互补方法及SDS-PAGE和银染技术鉴定了wzm基因和糖基转移酶基因orf16，并证实了wzm基因的存在和orf16已经失去了功能。又进一步预测了单糖D-Fucf的生物合成途径。当破译了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇后，发现它与鲍氏志贺氏菌6型的整个O-抗原基因簇序列有99.8-100％的相同性。进一步对它的O-抗原的结构、遗传和进化及致病菌形成机理进行研究，首次发现一个完整的基因簇的横向转移是由一个IS插入到重要的功能基因内引起，也发现了一株进化历史最短的志贺氏菌：鲍氏志贺氏菌6型，是在距今不到1万年才从鲍氏志贺氏菌10型进化而来。普遍认为志贺氏菌起源于大肠杆菌，但是对痢疾志贺氏菌3型和大肠杆菌O164的进化关系和致病菌形成机理的研究揭示出一个特例，就是大肠杆菌O164是在近期从痢疾志贺氏菌3型进化而来。而且通过序列的精确比对发现由于2个碱基的插入造成移码突变，导致重要功能基因缺失，产生了新的O-抗原，形成了新的致病菌：大肠杆菌O164--一株能引起爆发流行的EIEC。也研究了O-抗原结构很相似的大肠杆菌O56和O24的进化关系，基因的同源性较高，表明它们的进化关系密切。缺失了这两个菌的wzx、wzy基因和O24中预测不出功能的orf9基因，并在同一菌中进行了相应基因的互补实验。表明它们都是有功能的。志贺氏菌是随着人类进化而形成的非常重要的致病菌，和大肠杆菌有非常近的亲南开大学博士毕业(学位)论文之碑缘关系，本文通过对具有相同O一抗原结构的4对志贺氏菌与大肠杆菌序列分析发现，它们的序列相似性很高，具有相同的基因相同的排列顺序。进一步证实志贺氏菌属应被划入致病性的大肠杆菌属更合适。此外，发现二IB基因也是细菌横向转移的一个同源重组位点。对鲍氏志贺氏菌2型和大肠杆菌054序列的破译和分析发现2切了C基因很特殊，它远离另三个基因二IBI万1位于基因簇的3‘端。同样的情况出现在鲍氏志贺氏菌 9型中，这意味着柳了C在这三个菌中是一个重组位点。这两个结果使我们对同源重组位点有更新的认识。那就是一翻了双必盆C是细菌O一抗原基因簇同源重组频繁的区域，但在不同的菌中，重组位点会发生改变。本研究中有10个菌有二nB和二刀c，加上本实验室己经破译及网上搜索到的大肠杆菌的二nB和二刀C基因序列做进化树。这是第一次在大肠杆菌中对朋nB和二nC基因进行系统分析。使我们对*nB和~C的起源和介导的DNA的横向转移有更深刻的认识。大肠杆菌01360一抗原中含有非常罕见的人体内很需要的单糖Pseudaminic acid 的同类糖。大肠杆菌0136是一株EIEC，与另两株EIEC大肠杆菌0164和0124有血清交叉反应，我们破译它的序列后，通过同源性搜索鉴定了它的合成酶基因，并通过缺失和互补对仲冬厂进行鉴定。本研究破译的多个基因簇中都含有插入序列，发现这些插入序列可以分成两类: 一类是插入到O一抗原基因簇的重要功能基因中，导致基因缺失，产生新的O一抗原，形成新的致病菌。如:鲍氏志贺氏菌6型，大肠杆菌0164的IS，而且它们都是在很近的时期形成的，这种插入序列很少见。另一类是插入到O一抗原基因簇的ga1F和第一个基因之间，如鲍氏志贺氏菌13型和大肠杆菌056中的1S，大肠杆菌088和0161中的 H一reapeat。暗示这类插入序列能通过同源重组介导DNA的横向转移。所以，我们的结果也表明插入序列在细菌O一抗原的进化和致病菌的形成中扮演重要角色。总之，本研究破译了9株志贺氏菌和巧株大肠杆菌的O一抗原基因簇的全序列，通过对它们的遗传和进化的研究和通过合作对重要或特殊的O一抗原结构的研究及通过缺失和互补方法并结合SDS一PAGE和银染技术对重要基因的鉴定，共同诊释了志贺氏菌和大肠杆菌0一抗原基因簇的遗传特征，揭示了致病菌的进化和形成机理，也使我们对志贺氏菌和大肠杆菌的关系有了更清楚的认识。也表明DNA的横向转移是细菌表面多糖抗原基因簇进化的重要途径。这是世界上首次如此系统的
【学位授予单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R378
【图文】：

序列,合成模型,基因簇,大肠杆菌

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序列,基因簇,原基因,大肠杆菌

}遭啄画蔽奋刁图IK5的K一抗原的合成模型图2K5的K一抗原的基因簇3.合成大肠杆菌K一抗原的基因簇合成大肠杆菌K一抗原的基因在染色体上也是成簇排列，在组1和4中称为cPs(eapsuzegenecluster)，位于。一抗原基因簇上游的JuMstart序列之前〔65〕，也就是挨着O一抗原基因簇。在组2和3中称为kPs，图2列出K5的K一抗原基因簇。图3为组1和大肠杆菌K12的K一抗原基因簇:厅旧‘rstralnscaayaf]lse妇mont口胡了打划刀昭日怕50刁2脚心切。币旋哪幻叹阳用口按翔”妇nk时妙Is自协汀旧门污·食劝归沁卯。eS喇鱿‘口p了冈比污翩ke户旧伪脚邝Iorg的中，翻p，“招‘。洲m.八日C时叫时l破IF尹E.COIISt沮insWithgroupIK朗tigens动叻时，~，孤，伽，~印s(GROUP1CPSBIOSYNTHESIS)而旧印口9峨NTIGENHISTIDINEeIOSYNTHESIS)BIOSYNTHESIS

大肠杆菌

了大肠杆菌056的甲z了和~，突变菌株都不在产生正常的LPS。缺失了。基因的突变菌株H1097只产生核心寡糖和类脂A，缺失了班足y基因的突变菌株H1096只产生类脂A加核心寡糖加一个O一单位(见图4A)。用含有大肠杆菌056的分迈犷基因的表达质粒pLWIOOS和~基因的表达质粒pLWIOOg分别转化大肠杆菌056的缺失突变菌株后得到互补菌Hll02和HllO3，电泳表明互补菌产生正常的LPS(见图4B)。这些结果表明大肠杆菌056的邵逻犷和~基因是有功能的，鉴定了口2，f泞是甲艺了，口厂厂夕是二x基因。

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