携蜂毒素基因腺病毒载体的构建及体外抑瘤实验研究

发布时间：2020-08-17 10:23

【摘要】： 目的：将蜂毒素基因置于CMV(cytomegalovirus)启动子和AFP(α-fetoprotein)转录调控序列(rAFP)驱动下，构建重组腺病毒载体，进行体外转基因抑瘤实验，并观察蜂毒素基因转染对肝癌细胞恶性度的影响。 方法：人工合成蜂毒素基因，用Kozak序列优化翻译起始区，并进行人类最适密码子的转换，然后置于CMV启动子或rAFP之后，用细菌内高效同源重组法将目的基因重组入腺病毒质粒中；将腺病毒质粒用Pac Ⅰ酶切线性化后，脂质体介导转染293细胞进行腺病毒的包装。携有蜂毒素基因的腺病毒感染肝癌细胞后，RT-PCR实验观察蜂毒素基因是否发生转录；采用MTT法和~3H-TdR掺入法测定蜂毒素基因转染对肝癌细胞增殖的抑制作用；采用ELISA双抗体夹心法定量检测甲胎蛋白，流式细胞术检测CD54表达情况，以观察蜂毒素基因转染对肝癌细胞生物学性状的影响。并以CMV启动子作为对照，观察在rAFP驱动下，蜂毒素基因转染能否特异性地抑制AFP阳性细胞的增殖。 结果：携蜂毒素基因的重组腺病毒载体构建成功，RT-PCR实验表明蜂毒素基因可以得到转录。MTT与~3H-TdR掺入实验证明细胞在感染腺病毒后，其增殖率在前48小时的变化主要是受病毒本身的作用，而非目的基因的作用，特点是低滴度时抑制细胞的生长，高滴度时则刺激细胞的增殖。第72小时，病毒本身的作用基本消失，蜂毒素基因的作用凸现出来，表现为细胞的增殖受到明显抑制，且抑制效应与病毒滴度的对数呈正相关，可以认为是蜂毒素基因被转录翻译所起的作用。ELISA法检测甲胎蛋白表明蜂毒素基因转染可以降低AFP的生成量，流 式细胞术结果表明，蜂毒素基因转染可以抑制 CD54分子的表达。不同 启动子作用的比较表明，蜂毒素基因在rAFP的控制下，可以特异性地 古制AFPF性肝癌细胞64增殖。 结论：蜂毒素基因转入细胞后，不仅可以得到转录和翻译，且其作 用也足以抑制肿瘤细胞的增殖，并改变肿瘤细胞的生物学行为，证明 通过转蜂毒素基因的方法可以起到抗肿瘤的作用。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R346

【参考文献】

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本文编号：2795199