截短的乙型肝炎表面抗原分子的表达及其抗原特性的研究

发布时间：2020-08-20 20:16

【摘要】： 目的：构建截短的乙型肝炎表面抗原分子的原核和真核表达重组质粒，然后分别在大肠杆菌中诱导表达并纯化表达蛋白及在真核细胞中表达目的基因，并检测其抗原特性。为乙型肝炎的预防和治疗性疫苗免疫原的选择进行初步的研究和探讨。 方法：本研究利用聚合酶链反应(PCR)，通过设计带有不同酶切位点的一对引物，从质粒pEcob6特异性扩增HBsAg蛋白羧基末端152个氨基酸(S1)和124个氨基酸(S2)的基因片段，分别将二者克隆到质粒pBKS(+)的多克隆位点，筛选重组克隆。将经过PCR和双酶切鉴定的重组克隆进行序列测定。测序结果表明扩增的基因片段与拟扩增目的基因序列完全一致。 运用分子生物学技术，在pBKS-S1、pBKS-S2基础上分别构建了原核表达载体pET32a(+)-S1、pET32a(+)-S2；pQE30-S1、pQE30-S2(同时在已有的pBKS-S基础上构建了pET32a(+)-S、pQE30-S)和真核表达载体pCDNA3.1-S1、pCDNA3.1-S2、pCDNA3.1-S。用SDS-PAGE、Western blot、ELISA及免疫细胞组织化学等方法对原核、真核表达产 重庆医科人学博l：学位论义 物进行了检测。 结果： 1．成功从质粒pEcob6特异性扩增了S1和S2的基因片段，分别 将二者克降到质粒pBKS(+)，经过PCR、双酶切攀定、序列测定等 检测。结果表明扩增的基【大J片段与拟扩增目的基因序列完全一致。 2．分别成功构建‘』，原核表达载体pET32a(+)一S 1、pET32a(+)一S2： pQE30一S1、pQE30一S2及pET32a(+)一S、pQE30一S和真核表达载体 pCDNA3．1-S1、pCDNA3．1一S2、pCDNA3．1一S。 3．将原核表达载体pET32a(+)一S1、pET32a(+)一S2；pQE30．S1、 pQE30一S2在相应表达宿主菌(BL21、SGl3009)中得到表达，表达量 可达菌体总蛋白的20％，其分子量与预计理论值相符合。而真核表达 载体pCDNA3．1一S1、pCDNA3．1一S2、pCDNA3．1一S则在不同真核细胞 (HepG：、COS一7)中得到表达。具体结果如下： 1)．S1基因能在细菌BL21(pET32a(+)一S1)、SGl3009(pQE30一 S1)和HepG2细胞(pCDNA3．1-S1)、COS一7细胞(pCDNA3．1一S1) 中表达，其表达产物能被抗HBsAg a单克隆抗体识别。 2)．S2基因能在细菌BL21(pET32a(+)一S2)、SGl3009(pQE30一 S2)和HepG2细胞(pCDNA3．1-S2)、COS一7细胞(pCDNA3．1一S2) 中表达，其表达产物能被抗HBsAg a单克隆抗体识别。 3)．S基因不能在细菌BL21(pET32a(+)一S)、SGl3009(pQE30一 S)中表达；而能在HepG2细胞(pCDNA3．1一S)、COS一7细胞 重庆医科人学f啦I j学位论义 (pCDNA3．1一S)中表达，其表达产物能被抗HBsAg a单克隆抗体识 刖。 结论：截短的乙型肝炎表面抗原分子的原核和真核表达’重组质粒 成功被构建及分别在人肠杆菌Efl得到诱导表达和存贞核细胞IfJ表达， 并检测剑其表达产物的抗原特性。为乙型刖：炎的预防和治疗性疫苗免 疫原的选择进行了成功的初步研究和探讨。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392.1
【图文】：

500250L.ILeC:51图1一2Figl一2S1/SZPCR扩增产物1.0%琼脂糖电泳1.0%agarosegeleleetroPhoresisofPCRProductsfromPEeob6重组克隆的酶切鉴定用相应的限制性内切酶分别酶切相应的重组质粒，能从重组质粒上切下大小约300、500bp的片段。结果见图l一3。A，D:enz卿edpB朽一51万，E:.n:卿edPB招一52500-200一LaneC:IkbGener飞辽ermarker图1一3Figl一3重组质粒酶切产物1.0%琼脂糖电泳1.0%agarosegelelectroPhoresisofen尽medrecombinantPlasmids3.重组克隆的PCR鉴定以重组质粒为模板，用相应的引物，分别PCR扩增51，52，能扩增出大小约300、500bp的片段。结果见图l一4。L81LeAL奴eB，L奴eC

C:enz卿edpQ助0一51LaneD，卫，F:enz，edpQE30一咫图2一4重组质粒酶切产物1.0%琼脂糖电泳FigZ一41.0%agarosegelelectroPhoresisofen习medreeombinantPlasmids2)用相应的限制性内切酶分别酶切切下大小约700bp的片段。结果见图S基因相应的重组质粒，能从重组质粒上2一5。bP50003000750500L红eA:IKBDNAmarkerL幼eB:enz卿edPBKS一SL心eC二enz物edpQE30一SL奴eD:enz卿edPET32a--S图2一5F192一5重组质粒酶切产物1.0%琼脂糖电泳1.0%agarosegeleleetroPhoresisofen刃medreeombinantPlasmids35

LaneG:IkbGener，dermarkerS00图2一3重组质粒酶切产物1.0%琼脂糖电泳FigZ一31.0%agarosegeleleetroPhoresisofen即medreeombinantPlasmidsABCDEFbP3000L吸.A:IkbGenerl众er.arker500LaneB，C:enz卿edpQ助0一51LaneD，卫，F:enz，edpQE30一咫图2一4重组质粒酶切产物1.0%琼脂糖电泳FigZ一41.0%agarosegelelectroPhoresisofen习medreeombinantPlasmids2)用相应的限制性内切酶分别酶切切下大小约700bp的片段。结果见图S基因相应的重组质粒，能从重组质粒上2一5。bP50003000750500L红eA:IKBDNAmarkerL幼eB:enz卿edPBKS一SL心eC二enz物edpQE30一SL奴eD:enz卿edPET32a--S图2一5F192一5重组质粒酶切产物1.0%琼脂糖电泳1

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 房德兴,李法卿,谭维国,陈华标,金慧英,李素芹;乙型肝炎表面抗原124aa分子在大肠杆菌中的高效表达[J];免疫学杂志;1999年03期

2 任红,TimHarrison;重组HBsAg免疫逃逸突变体的表达及其抗原性分析[J];中华微生物学和免疫学杂志;1996年02期

本文编号：2798395