IL-6相关新基因的克隆鉴定、表达纯化及结构功能预测

发布时间：2020-08-21 02:06

【摘要】： 细胞因子作用于相应受体时的一个重要结果是诱导基因表达，细胞膜上的受体接收特定的来自胞外的信号刺激后将这种信号传至胞内，产生一系列新的信号分子和有序的系列化级联反应，最终对细胞乃至整个生物体的生理功能产生影响。白细胞介素-6（IL-6）是一种多功能的细胞因子。其作用于敏感细胞时，必将导致一些基因的表达，克隆这些基因，必将有助于进一步阐明IL-6信号转导途径及发现新的信号分子，同时也将有助于进一步阐明IL-6与某些疾病的相关性。我们用cDNA-RDA法和改进的DD-PCR法，分离了IL-6处理前后U937细胞差异表达的基因片段；之后用电子克隆和RT-PCR技术克隆了一些新基因片段的全长cDNA序列；并用生物信息学方法对新基因的结构和功能预测；最后在原核系统对其中的STRF8基因进行了表达和纯化。首先，分离了16个差异表达的基因序列，反向Northern杂交证实了它们与IL-6的相关性。序列分析表明，其中7个差异表达的EST代表在细胞生命活动或信号转导中有重要作用的已知基因，9个是与IL-6作用相关的新基因片段。这9个新基因片段的GenBank接受号分别为： BE644245、BE644246、BE644248、BE644249、BE644250、BE761007、 BE761008，BE761009和BE761010。利用dbEST库的资源，对所获得的新基因片段进行了电子延伸，获得了较长的cDNA序列；ORF分析后，对具有典型ORF结构的全长cDNA序列，用RT-PCR法进行了实验验证。结果有5个全长cDNA序列被克隆，分别命名为STRF2、STRF6、STRF7、STRF8和STRF11。时间表达谱的分析进一步证明了5个新基因与IL-6的相关性，Norhtern blot证实了STRF7 和STRF8在IL-6作用后的U937细胞中表达量升高。上述结果提示这些新基因与IL-6作用相关。用生物信息学方法对新基因的电子表达谱、染色体定位、相应蛋白的物理化学性质进行了分析，并进行了结构和功能预测。结果表明，STRFS 具有多个磷酸化位点，具有硫氧还蛋白家族的结构功能域及硫氧还蛋白的活性中心，在氨基酸水平上与鼠的硫氧还蛋白有32％的同源性和 50％的相似性。这些证据都表明，STnys可能是人类的硫氧还蛋白家族的一个新发现的成员。STRF7与人的同源框蛋白CDX－4基因部分同源。同源盒基因在进化中高度保守，并且作为转录因子家族的成员调控那些在脊椎动物和非脊椎动物的发育过程中控制组织和细胞特异分化的基因的表达。同时STRF7和酵母的转录调节蛋白ADR6也有部分同源。这些都提示STRF7可能一个新发现的转录因子。最后，将新基因 STRFS连接到 PET28a卜）载体上，诱导后在 BLZI（de3） S 菌株中获得了可溶性的高表达，之后用钻离子亲和层析柱进行了纯化，为进一步的功能实验打下了基础。总之，我们获得了5个与IL－6相关的新基因，并对它们的结构和功能进行了预测，其中STRFS基因在原核系统中进行了表达和纯化。
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：Q785

【引证文献】