穿支体区间的Choke vessels扩增机制初探
发布时间：2020-08-22 01:09
【摘要】：研究背景各种原因引起机体的组织缺损、深层组织(如筋膜、肌肉、骨、血管或神经等)外露,包括创伤、肿瘤切除术后、糖尿病溃疡、坏疽、褥疮,以及先天性畸形等,都需要进行修复。临床上最常用的修复方法是：基于机体自身某局部的一穿支血管,切取以该血管血供为基础的皮肤或复合组织作为供体,对缺损部位进行修复、重建,阻止深层组织继续外露。此类自体移植、用于修复缺损的“以某穿支血管为基础的皮肤组织块”,即可称为穿支皮瓣(Perforator Flap)。穿支皮瓣是最近几十年伴随显微设备发展起来的、用于修复组织缺损的一项新技术,它是在传统的肌皮瓣术式基础之上,仅选择性切取供养皮瓣的穿支血管,并以该穿支血管作为血管蒂进行移植修复,保留了供区的主要血管,且无须携带肌肉组织,从而大大地减少了对供区的继发性损伤,因而得以广泛地应用于临床。然而,单纯的穿支皮瓣仅以管径细小的皮肤穿动脉为蒂进行取瓣,穿支血管并非主干,故其供皮面积偏小。在一些较大的组织缺损(如烧伤、交通伤等,损伤面积较大且损伤严重),其损伤面积常大大地超过单个轴型血管穿支皮瓣所能覆盖的范围,这便给临床修复重建带来了极大的困难,为适应这种大面积修复的需要,临床上也随之出现了基于两个或两个以上穿支血管的大皮瓣或超大皮(组织)瓣,因此,如何对其进行扩大切取便成了皮瓣外科的一个重要课题。对于这些超大型的联合皮(组织)瓣而言,其血液供应的稳定性、穿支血管体之间微血管的有效吻合情况等,是决定其成活率的关键因素。早在1987年,Taylor等应用血管造影技术对人体及其一些哺乳动物的皮动脉进行了细致入微的研究,统计出人体平均有口径≥0.5mm的皮肤穿支血管374支,可切取近40个穿支血管皮瓣。并根据皮肤内血管由深向浅呈立体三维分布的特点与规律,提出了“Vascular Territories"(血管体,angiosome)的概念,他们认为,每一支知名的皮肤血管的供区都不仅仅局限于其分布范围内的皮肤及皮下组织,而是一个包含有同一区域内相应的肌肉、肌腱、骨骼等多种组织在内的三维组织块,称之为“血管体”(angiosomes),全身体表共可划分为40多个这样的“血管体区”,两“血管体”之间则借微血管吻合(即choke vesse ls)互相连接。血管体(或称之为血管分布区域)新这个概念的提出,不但促进了多种皮瓣新供区的发现、新术式的产生,而且也促进了对传统皮瓣移植方式的改进。差不多同一时期,Cormack等通过分析相邻血管体之间的关系,将皮肤的血管供区依次分为三个层次：解剖学供区,血流动力学供区以及潜在供区。即：1.某一源动脉呈树形分布的立体区域,其所到之处为解剖学供区(anatomical territory),'除与Taylor等提出的“血管体区”相当,是最基本的血管供区。2.每一个解剖学供区与其周围相邻动脉之间均有丰富的吻合。当一侧血管被切断或阻断时,则其下游血管内的血压下降。此时,解剖学供区血管内的血流就会跨越原来的吻合部位(choke vessels)向其体区进行供血。这种紧邻解剖学供区的扩张部分被称之为血流动力学供区((lynamic territory)。3.在跨越动力学供区的基础上,若再继续向远邻的供区延伸,则称其为潜力供区(potential territory)。这表明：有可能将皮瓣从解剖学供区向紧邻的动力学供区扩张,得到较大的皮瓣,若再继续向远邻的潜力供区延伸,则可得到更大的皮瓣。但是,能否成功扩大切取的前提是必须知道：不同供区之间是否存在有效的吻合血管(即choke vessels),能够建立起“新的血液循环体系”将三个不同的小供区变成一个大供区。因此,各供区间血管网的形态学特征,其血流动力学特征,以及如何加强体区间血管的有效沟通便成了皮瓣外科最大、最重要也是最难的课题。既往对于穿支体间微血管吻合的研究,多在于尸体层面进行的大体灌注,由于尸体的“非生理性”,对其小血管的研究势必不能反映活体的生理状态；再则,由于灌注剂的类型、粘稠度、灌注压力等因素的限制,仅灌注效果就未必能取得良好状态。本课题选取SD大鼠为实验对象,制作皮瓣模型,通过安装自行设计、改良的皮肤观察窗,在直视下进行实时观察,对组织进行分子水平表达物质的测定,总结血管体间吻合的扩增规律。在此基础上,选择不同时间段进行灌注、标记微血管,以期能重建、还原微血管吻合的空间结构。目的1.对实验组前期设计的皮肤观察窗进行改良,以期重新设计并制作出更符合本实验需求的皮肤观察窗；采用大鼠皮肤观察窗,直视下观察体区间微血管吻合(且choke vessels)在不同时间点的扩增情况及吻合变化,并初步得出其变化规律：2.采用大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells of rat, MSCs-rat)和血管内皮细胞因子(vascular endothelial growth factor of rat, VEGF-rat)这两种干预方法,观察它们对于choke vessels扩增过程的影响；3.获取组织进行Rt-PCR、免疫组化等检测,确定分子表达物变化规律；4.利用明胶-氧化铅对大鼠全身动脉进行灌注,取皮行X摄片,计算、比对不同组的各时间点微血管吻合处的微血管密度(灰度值)；5.结合Evans Blue对血管内皮标记,初步探讨激光共聚焦显微镜在大鼠皮肤血管三维重建中的应用价值,以期研究大鼠皮肤相邻血管体之间choke vessels形态学特征,并探索出精度更高而又简便实用的血管3D可视化新技术。方法第一部分,是本课题前期实验部分：取成年SD大鼠6只,通过氧化铅-明胶造影初步了解大鼠背部主要穿支体的分布；取成年SD大鼠6只,安装皮肤观察窗后(不切取皮瓣、不离断穿支蒂),通过录像初步了解大鼠皮肤穿支动、静脉伴行情况；另外,选取体重为70±10g的幼龄SD大鼠12只,自行提取、培养MSCs,检测其纯度合格后冻存在-80℃的冰箱中,以满足后期实验的需要；第二部分、第三部分是本课题主体实验部分。第二部分：选取SD大鼠为实验对象,通过制作SD大鼠皮瓣模型(即：使得相邻两个穿支血管的体区互为动力学供区),在背部皮肤上安装自行设计、改良的皮肤观察窗,随机编号分三组,分别为单纯皮窗组、MSCs干预组(皮窗+MSCs组)和VEGF干预组(皮窗+VEGF组)：1.体视显微镜观察部分：取18只SD大鼠,随机编号分三组。(1)单纯皮窗组通过安装皮肤观察窗,在体视显微镜下对大鼠背部皮肤血管体间的微血管吻合(choke vessels)处的管径、密度变化情况,以及微血管吻合处的延时扩增情况进行长时间的活体实时观察；(2)MSCs干预组和VEGF干预组,分别加入MSCs和VEGF这两个干预因素,再通过观察窗,在体视显微镜下对大鼠背部皮肤血管体间的微血管吻合处的管径、密度变化情况,以及微血管吻合处的延时扩增情况进行长时间的活体实时观察,并探索常见的血管生成相关的分子因素对微血管吻合扩增的影响；2.实验室检测部分：取72只SD大鼠,随机编号分三组：在各组大鼠背部观察区皮肤上,按照不同时间点进行取材,行HE染色、Rt-PCR、免疫组化等检查,检测毛细血管表达水平和分子表达物的表达水平(VEGF-mRNA),并运用统计学软件在不同时间点及不同组别间作比对,总结血管体之间的微血管吻合的变化规律,探究其受影响的因素；第三部分,不分组、不安装皮肤观察窗,仅切开皮瓣暂时结扎穿支蒂血管,按不同时间点松开结扎后,利用灌注、标记技术记录微血管吻合区的扩增情况,对不同时间点对血管密度进行分析,并力图还原微血管的空间构筑。1.氧化铅-明胶灌注造影：取48只SD大鼠随机编号,利用氧化铅-明胶灌注造影技术,每组分不同时间点对大鼠全身动脉进行一体化灌注,自大鼠腹部正中线处开始剥下整皮,应用X线进行摄影,用Scion Image Beta 4.02软件对穿支体间吻合的血管密度及其变化进行分析；2.荧光示踪技术标记：取8只SD大鼠,利用荧光示踪技术标记血管内皮细胞,应用去细胞技术去除适量的皮肤表皮细胞,在(双光子)激光共聚焦显微镜下观察、全层扫描,并力图在MIMICS13.0中重建生理状态下和非生理状态下的微血管吻合的空间立体结构。主要实验步骤如下：1.第一部分(1)提取、培养、收集、冻存MSCs:取体重约70±10g的幼龄SD大鼠12只,采用全骨髓贴壁培养法提取、培养MSCs,并通过流式细胞仪检测细胞表面抗原CD90、CD45对该细胞进行鉴定,收集P3代MSCs冻存、备用。(2)大鼠皮肤血管体的分布：取成年SD大鼠6只,麻醉、脱毛后采用左心室灌注法灌注明胶。氧化铅混悬液,并取整皮行X线扫描,观察大鼠皮肤的主要穿肢体及其间的吻合位置,为下一步实验中选择穿支体提供借鉴和参考;(3)明确大鼠皮肤动、静脉分布：取成年SD大鼠6只,根据X线扫描结果,取大鼠麻醉、脱毛后,选择合适穿支体(左、右髂腰动脉穿支体)之间的微血管吻合作为观察区,安装大鼠皮肤观察窗,以静脉留置针经颈总动脉插管,并灌注Evans Blue溶液,录像、记录皮肤观察窗内血流变化、动静脉伴行情况；2.第二部分取SD大鼠90只,麻醉、脱毛、制作皮瓣模型；安装皮肤观察窗后,再随机编入单纯皮肤观察窗组、MSCs干预组和VEGF干预组,每组30只SD大鼠。MSCs干预组和VEGF干预组,在观察窗内分别按需局部注射MSCs和VEGF,余同单纯皮肤观察窗组。每组接着两部分操作：(1)体视显微镜观察：每组随机选取6只SD大鼠,采用体视显微镜在不同时间点(Oh、24h、48h、72h、96h、6d、10d和16d)对观察窗内的穿支体间吻合区进行直视观察、拍照记录,照片导入Image Pro Plus6.0中,测量不同时间点的血管直径,并做不同时间点和各组间对比：(2)分子生物学、组织化学检测：每组24只大鼠,在D0(0h)、D1(24h)、D2 (48h)、D3(72h、D4 (96h)、D6(6d)、D10(10d)和D16(16d)等8个不同时间点获取大鼠背部皮肤组织标本(每个时间点3只SD大鼠、每只大鼠取2部分皮肤组织,计6个皮肤组织标本),获取的标本用于脏染色、免疫组化(第Ⅷ因子标记)的检测；根据免疫组化结果,选取血管增生变化较明显的3个时间点的标本行Rt-PCR检测,明确皮肤内VEGF-mRNA的表达水平规律。3.第三部分取SD大鼠,麻醉、脱毛后,切取皮瓣但不离断穿支体的血管蒂,仅用较粗的丝线以活结结扎血管蒂部,再原位缝合皮肤(不安装皮肤观察窗)；按照单纯皮肤观察窗组总结的“微循环扩增规律”,按照不同时间点解除穿支体血管蒂的丝线结扎,行以下操作：(1)经左心室行体循环动脉氧化铅-明胶灌注：取大鼠48只,在DO(0h)、D1(24h)、D2(48h)、D3(72h)、D4(96h)、D6(6d)、D10(10d)和D16(16d)等8个不同时间点(每个时间点为6只),麻醉后经左心室插管并关注明胶-氧化铅混悬液,待明胶凝固后自腹部正中线处剥下整皮,应用X线进行摄影获取图片,导入Scion Image Beta 4.02中,计算穿支体以及体间吻合区的“谷峰灰度比”(穿支体部血管密度高,灰度值高,为“峰”；体区间吻合区灰度值低,为“谷”),分析穿支体区间血管吻合的密度及其变化规律；(2)经左心室进行体循环动脉Evans Blue标记：取大鼠8只,按微血管扩增规律,在每个时间点进行灌注、标记。大鼠麻醉后经左心室插管并灌洗体循环血管,再快速注入Evans Blue的生理盐水溶液,以充填体循环血管、标记血管内皮细胞,再部分去除皮肤表层细胞,经腹正中线获取大鼠整皮,置目标观察区于激光共聚焦显微镜(或双光子激光共聚焦显微镜)视野下观察、全层扫描,获得图片导入MIMICS13.0进行三维重建,力图还原各种状态下的微血管吻合的空间立体结构。本课题技术路线图如下：4.统计学处理以上三部分实验,均采用SPSS 13.0统计学软件分析获得数据。所有计量资料用叉±s表示。各组间比较方差齐时采用ONE-WAY ANOVA,方差不齐时采用Welch F方法；重复测量数据采用重复测量方差分析(REAPTED MEASURE ANOVA),P0.05为表示差异有统计学意义。结果第一部分：1.通过体外培养、扩增,得到均一性好、增殖能力强的大鼠系MSCs。倒置显微镜观察呈原代MSCs-Rat主要呈梭型,部分呈三角形或多角形,集落样贴壁生长,排列有明显方向性,可成漩涡状。传代后细胞基本呈梭形,并呈现典型的放射状生长,且5代以内细胞形态较稳定,细胞增殖速度较快。经流式细胞仪检测,结果显示第3代MSCs的特异性表面标志物：CD90阳性,阳性率为96.8%,CD45阴性,阳性率为1.2%,提示第3代贴壁细胞主要是MSCs。2.经明胶氧化铅灌注-X线扫描,发现大鼠主要穿支体有：胸外侧动脉(lateral thoracic artery,LTA)、胸背动脉(thoracodorsal artery,TDA)、肋下动脉(subcostal artery,SCA)、髂腰动脉(iliolumbar artery,ILA)、腹壁浅动脉(superficial epigastric artery,SEA)、臀上动脉(superior gluteal artery,SGA);其中上背部横向跨中缝的吻合较明显(即左、右胸背动脉之间以及左、右肋下动脉之间),上背部纵向的吻合也较明显(胸背动脉和同侧肋下动脉之间)；而在下背部,不管是纵向吻合(髂腰动脉和同侧的肋下动脉之间),还是横向跨中缝的吻合(左、右髂腰动脉之间),其吻合处的微血管分布较稀疏,吻合相对不明显。尤其是左、右髂腰动脉穿支体之间横向跨中缝的吻合区,在本实验中可作为观察微血管吻合扩增的理想部位。3.通过安装皮肤观察窗、Evans Blue灌注,可观察到观察窗内血管体的动脉最先出现染色,随后范围依次扩大,在20-30s之间,动脉着色而静脉未着色,皮肤上的动、静脉伴行关系清晰可见,肉眼观察发现：动脉管径较细、分布密度较低,静脉则管径粗,且分布范围广,基本遍布整个视野；至50s时,静脉也被Evans Blue完全充填、蓝染。第二部分：1.通过体式显微镜观察不同时间点及不同组间处理对血管扩增率的影响,得到：不同时间点之间血管扩增率有显著差异(1.14±0.14,1.33±0.18,1.504±0.26,1.97±0.32,1.98±0.47,1.75±0.49,1.89±0.39；F=32.965,P0.001)；各组不同时间点之间血管扩增均有显著差异(F=11.726,P0.001；F=19.893,P0.001和F=6.262,P0.001)。MSCs干预组曲线呈逐渐上升,到达顶峰后又逐渐下降的趋势；单纯皮肤观察窗组及VEGF干预组呈逐渐上升、到达顶峰后下降然后再上升的双峰趋势。三组之间血管扩增水平有显著性差异(1.544±0.42,1.83±±0.52,1.58±0.39；F=6.981,P=0.005),在D3、D6、D10三个时间点有显著性差异(P=0.014,P=0.037,P=0.003)。在D3、D6、D10三个时间点,单纯皮肤观察窗组血管扩增率显著低于MSCs干预组,差异均有统计学意义；D6、D10两个时间点,VEGF干预组血管扩增率显著低于MSCs干预组,差异有统计学意义；7个时间点单纯皮肤观察窗组血管扩增率与VEGF干预组均无显著性差异。不同时间点与不同组别之间无交互效应(F=2.064,P=0.059)。2.HE染色：单纯皮肤观察窗组可见中、小血管分布,但小、微血管的密度较低,D3微血管密度有所增加；MSC s干预组中,各时间点均可见大量小、微血管分布,以D6为最高；VEGF干预组中,各时间点可见中、小血管分布,也可见小、微血管分布,但密度相对较低,D3d微血管密度有所增加。3.免疫组化检测皮肤切面内皮细胞表达(第Ⅷ因子标记),观察不同时间点及不同组间处理对皮瓣内血管新生的影响：不同时间点之间血管新生有显著差异(2.11±1.01,3.03±±1.53,2.39±±1.29,2.16±1.36,1.844±1.36,1.67±±1.28,1.27±0.99；F=50.695,P0.001)；各组不同时间点皮瓣内血管新生均有显著差异(F=15.751,P0.001；F=22.610,P0.001和F=24.676,P0.001)。三组曲线均呈逐渐上升,到达顶峰后又逐渐下降的趋势。三组之间血管新生水平有显著性差异(0.84±0.41,3.13±1.34,1.65±0.95；F=313.980,P0.001),除DO三组间无显著性差异外,其余各个时间点均有显著性差异,且均为P0.001。除D1外,单纯皮肤观察窗组血管新生显著低于MSCs干预组和VEGF干预组,差异均有统计学意义；且除D1外,其他时间点MSCs干预组血管新生显著高于VEGF干预组。不同时间点与不同组别之间存在交互效应(F=8.733,P0.001)。4.根据免疫组化及体式显微镜的观察结果,选取D0、D3、D6作为Rt-PCR检测时间点。不同时间点及不同组问皮肤VEGF-mRNA表达水平：不同时间点VEGF-mRNA表达水平有显著差异(1.56±0.21,7.47±3.71,13.82±6.96；F=244.617,P0.001)；各组不同时间点之间VEGF-mRNA表达水平均有显著差异(F=118.678,P0.001；F=98.100,P0.001和F=138.817,P0.001)。三组曲线呈上升趋势,D3、D6时,、VEGF-mRNA表达水平均显著高于DO,且D6点VEGF-mRNA表达水平显著高于D3。三组之间VEGF-mRNA表达水平有显著性差异(4.47±2.84,12.08±9.20,6.30±3.97；F=110.135,P0.001),除DO外,D3、D6两个时间点有显著性差异(P0.001,P0.001)。在D3、D6两个时间点,单纯皮肤观察窗组VEGF-mRNA表达水平显著低于MSCs干预组和VEGF干预组,差异均有统计学意义；D3、D6两个时间点,VEGF干预组VEGF-mRNA表达水平显著低于MSCs干预组,差异有统计学意义。不同时间点与不同组别之问存在交互效应(F=33.552,P0.001)。第三部分：1.X线扫描：不同时间点的X线谷-峰灰度比有显著性差异；与DO组相比,D2、D3、D4、D6、D10的谷峰密度均显著增多(P=0.001,P0.001,P0.001,P=0.013,P=0.010,P=0.036)；与D1相比,D16谷峰密度显著降低(P=0.009)；与D2组相比,D6、D10、D16的谷峰密度均显著增多(P=0.038,P=0.036,P0.001)；与D3组相比,D4、D6、D10、D16的谷峰密度均显著增多(P=0.038,P=0.004,P=0.007,P0.001)。2.血管内皮细胞经荧光剂标记、部分去除皮肤表皮层细胞后,利用激光共聚焦显微镜对全层皮肤进行扫描,能较好地显示小血管,利用MIMICS 13.0等软件,可以对血管体区之间的微血管吻合进行三维空间构筑的重建。结论1.在本课题组前期研究结果的基础上,成功改良、制作了大鼠背部皮肤观察窗,应用后可在直视下实时观察血管及其扩增情况,其适用于在活体上应用、研究生理状态下的血管；2.通过皮肤观察窗发现：本实验设计的皮瓣模型中,能有效诱使左、右髂腰动脉穿支体之间choke vessels的扩增；皮肤扩增呈现“双峰”规律。给予MSCs干预后,微血管的扩增速度提前,扩增程度显著增加；给予VEGF干预后,微血管密度增加,血管扩增速度有所提前,扩增程度增加不明显。3.利用明胶-氧化铅灌注法进行全身体循环动脉灌注,能较好显示皮肤血管,可以明确皮肤穿支血管体的分布,在制作皮瓣模型后微血管的扩增过程中,能较好地显示微血管密度(灰度值)变化,在进行血管研究时,仍然是一种较好实验手段。4.本实验以E vans blue标记皮肤血管内皮细胞,结合激光共聚焦显微镜对全层皮肤进行无创、连续扫描,获取的图片信息在MIMICS中,成功对血管形态尤其是微血管的三维空间构筑进行重建。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R322
【图文】：
－；＾１６．ＭＳＣＳ的移植逡逑（１）取巧细胞，同细胞传代的（１）邋￣邋（５）步歘，并进行细胞计数，倒去逡逑离也管中的上清液，ＰＢＳ溶液洗}悖脖楹螅蒙硌嗡涑上赴海髡稿义习ǘ任福埃兀保埃迪赴玻瞪剑诲义希ǎ玻┰诖笫蟊巢科し艄鄄齑澳冢芸埽∪。蹈龉潭ㄎ恢茫茫担酰煳㈠义狭孔⑸淦鳎诠鄄齑按植科し舻钠つ谧⑸洌瞪剑闱傻阆赴海ǎ停樱茫笙赴ㄥ义隙任福埃兀保埃蹈觯玻瞪剑浚程欤贝危⒃谔迨酉晕⒕迪鹿鄄臁⑹胂嗷恼兆鲥义霞锹迹诲义希步峁义希玻贝笫笃し粞芄鄄齑吧杓啤⒏牧煎义匣诒究翁庾榍捌谑笛榻峁颐亲孕猩杓啤⒏牧计し艄鄄齑埃ㄆご埃┨族义霞ㄍ迹保保ｅ义
本文编号：2800073
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R322
【图文】：
－；＾１６．ＭＳＣＳ的移植逡逑（１）取巧细胞，同细胞传代的（１）邋￣邋（５）步歘，并进行细胞计数，倒去逡逑离也管中的上清液，ＰＢＳ溶液洗}悖脖楹螅蒙硌嗡涑上赴海髡稿义习ǘ任福埃兀保埃迪赴玻瞪剑诲义希ǎ玻┰诖笫蟊巢科し艄鄄齑澳冢芸埽∪。蹈龉潭ㄎ恢茫茫担酰煳㈠义狭孔⑸淦鳎诠鄄齑按植科し舻钠つ谧⑸洌瞪剑闱傻阆赴海ǎ停樱茫笙赴ㄥ义隙任福埃兀保埃蹈觯玻瞪剑浚程欤贝危⒃谔迨酉晕⒕迪鹿鄄臁⑹胂嗷恼兆鲥义霞锹迹诲义希步峁义希玻贝笫笃し粞芄鄄齑吧杓啤⒏牧煎义匣诒究翁庾榍捌谑笛榻峁颐亲孕猩杓啤⒏牧计し艄鄄齑埃ㄆご埃┨族义霞ㄍ迹保保ｅ义
本文编号：2800073
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