MiR-29靶向抑制Robol表达调控小鼠骨髓间充质干细胞增殖的研究

发布时间：2020-08-21 21:24

【摘要】：第一部分沉默Robo1对小鼠骨髓问充质干细胞增殖的影响 目的：研究Robo1对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响。 方法：体外培养小鼠BMSCs,构建siRNA载体,通过脂质体转染BMSCs,靶向沉默Robo1, QPCR和Western blot法验证沉默效率,MTT和Brdu法检测沉默Robo1基因后对BMSCs增殖的影响。 结果：Robo1-siRNA转染BMSCs后,Robo1基因表达量相较于对照组Con-siRNA下调3倍左右,而且Robo1蛋白的表达水平相较于Con-siRNA组也明显下调；Con-siRNA和Robo1-siRNA分别转染BMSCs, MTT及Brdu法检测结果显示使用siRNA沉默Robo1基因的BMSCs细胞生长受到显著抑制, 结论：Robo1与BMSCs生长密切相关,在Robo1被沉默后,BMSCs生长受到明显抑制。 第二部分靶向调控Robol的miRNAs的筛选及鉴定 目的：筛选及鉴定靶向调控Robol的miRNAs。 方法：用Targetscan、miRNAda等软件进行预测,以及文献查询,筛选出最有可能靶向抑制Robo1的miRNAs,并用miRNAs的mimic处理细胞,Western blot检测BMSCs中Robo1的表达差异,找到能明显引起Robo1变化的miRNA。最后用双荧光素酶报告基因法验证miRNA对Robo1的靶向调控作用。 结果：利用生物信息学软件对Robol可能的靶miRNAs进行了分析,从众多的靶miRNAs中筛选出最可能的靶miRNAs:miR-218、 miR-29、miR-146、miR-148、分别用miR-218、miR-29a、miR-146和miR-148mimics通过脂质体2000转染BMSCs, Western blot结果显示,转染miR-29a时,Robol下调最为明显。在转染克隆有野生型Robo13’-UTR质粒的实验组中,检测荧光素酶活性显示miR-29组与空白组比较P0.01; miR-29组与阴性对照组比较P0.01,表明miR-29能与Robo1的3’-UTR结合,从而抑制萤光素酶的活性；而在转染克隆有突变型mutRobo13'-UTR质粒的实验组中,miR-29组与空白组和阴性对照组比较差异均无统计学意义,表明miR-29不能与mutRobo13’-UTR结合而抑制萤光素酶的活性。 结论:miR-29a通过与Robo1的3'-UTR结合而靶向抑制Robo1。 第三部分miR-29a靶向调控Robol抑制BMSCs增殖 目的：研究miR-29a靶向调控Robo1表达对BMSCs增殖的影响。 方法：采用慢病毒载体介导的miR-29a,根据miRNAbase上公布的pri-miR-29a的序列,合成并构建在慢病毒骨架质粒中,继而和慢病毒的包装质粒共转染工具细胞(293T,人胚肾细胞)进行慢病毒包装,继而裂解细胞,纯化带有pri-miR-29a的慢病毒颗粒,用于感染细胞并进行检测增殖的细胞实验。 结果：本实验成功构建和包装miR-29a'慢病毒,然后选用BMSCs的代表株,通过MTT和Brdu法证明,过表达miR-29a可抑制BMSCs的增殖能力。real-time PCR和Western blot结果证明Robo1转染BMSCs后,Robol表达量显著上调,过表达Robol组可增强BMSCs增殖能力,而共转染miR-29a和Robo1可回复miR-29a对BMSCs增殖能力的抑制作用。 结论：miR-29a可通过靶向抑制Robo1的表达而抑制BMSCs的增殖。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

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