热休克蛋白70抑制剂PFT-μ对诱导型一氧化氮合成酶诱导表达及蛋白稳定性的影响

发布时间：2020-08-23 21:16

【摘要】：背景:一氧化氮（Nitric oxide, NO）作为重要的信号分子和效应分子参与多种生理过程。机体通过一氧化氮合成酶（Nitric oxidesynthase, NOS）来合成NO，而诱导型NOS（inducible NOS, iNOS）因其具有的诱导表达及高效产生NO的特性使其成为机体免疫系统用来对抗入侵的微生物及清除自身肿瘤细胞的重要工具。热休克蛋白（Heatshock protein, HSP）是细胞内表达丰度最高的蛋白，在受到热休克等应激刺激时还会大量诱导表达。本课题组前期的研究证实HSP90对iNOS表达、活性及蛋白稳定性有重要影响，而作为与之紧密相关的HSP70是否有相似的作用目前尚不清楚。PFT-μ (Pifithrin-mu)是由George等于2009年首次在Mol Cell上报道的对HSP70具有高度选择性的一种小分子抑制剂，这为我们研究HSP70提供了一个有力的研究工具。到目前为止，利用PFT-μ治疗白血病等癌症方面的研究已有报道，但尚无在脓毒症等炎症方面的研究，另外也无HSP70与iNOS蛋白诱导及蛋白翻译后稳定性维持方面的报道。目的:拟探讨PFT-μ作为特异性热休克蛋白70抑制剂对IFN-γ诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞NO产生及iNOS表达的影响及分子调控机制；观察PFT-μ对脓毒症小鼠主要组织内iNOS表达的影响，观察PFT-μ是否参与iNOS蛋白翻译后的稳定性。方法:采用LPS/IFN-γ诱导RAW264.7巨噬细胞株构建炎症反应的细胞模型，Western-Blot检测iNOS等蛋白表达；定量聚合酶链反应(q-PCR)分析iNOS mRNA表达改变，Griess试剂测定培养基中NO的含量；HSP70siRNA转染RAW264.7巨噬细胞检测iNOS等蛋白表达；Western-Blot检测转录因子STAT1磷酸化水平及IRF-1诱导表达及胞核转移情况、染色质免疫共沉淀（Chromosome immunoprecipitate assay,ChIP）检测p-STAT1和IRF-1与iNOS基因启动子区的结合；Western-Blot检测胞浆可溶性及沉淀中iNOS蛋白；构建内毒素血症小鼠模型检测主要组织内iNOS表达水平的变化。结果:在IFN-γ诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞中，PFT-μ在8-12小时可抑制NO生成（P0.05）；PFT-μ在8-12小时可下调iNOS蛋白和mRNA表达（P0.05）；HSP70siRNA转染后可下调iNOS蛋白水平；PFT-μ不影响细胞内STAT1、磷酸化STAT1的水平，PFT-μ不影响IRF-1蛋白的表达及细胞内胞浆与胞核间转移；PFT-μ在2小时可降低p-STAT1和IRF-1对iNOS启动子区的结合（P0.05）；PFT-μ不影响iNOS mRNA的稳定性（P0.05）；PFT-μ不影响iNOS的蛋白稳定性；PFT-μ可抑制内毒素血症小鼠主要组织内iNOS的蛋白及mRNA的表达（P0.05）。结论：PFT-μ可降低LPS/IFN-γ诱导的RAW264.7中NO的生成、iNOS蛋白和mRNA表达；PFT-μ通过抑制转录因子p-STAT1和IRF-1与iNOS基因启动子结合而减少iNOS生成；PFT-μ对iNOS mRNA及蛋白质稳定性无影响；PFT-μ可在小鼠体内抑制iNOS表达。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【图文】：

时间依赖性抑制,蛋白,统计学意义

图 1-1 LPS/IFN-γ 诱导 RAW264.7 细胞生成 iNOS 蛋白被 PFT-μ 呈时间依赖性抑制1-1 iNOS protein expression in LPS plus IFN-γ-stimulated RAW 264.7 cells was blunT-μ. Pretreating cells with PFT-μ (20 μM) for 30 min and then stimulating with LPS/ml) plus IFN-γ (100 U/ml) at indicated time points. iNOS and GAPDH were detecteestern-Blot. GAPDH was used as an internal loading control. **, P<0.05 versus cont(LPS/IFN-γ) group, n=3. IFN-γ 诱导 RAW 264.7 iNOS 表达可被 PFT-μ 抑制结果如图 1-2 所示，IFN-γ 作用后，前 4 个小时几乎无 iNOS 表达，从给后 iNOS 表达增加，到 16 小时达到最高；用 PFT-μ 预处理 30 分钟后，达明显减弱，几乎看不到 iNOS 蛋白条带。灰度值分析后显示在 8、12 处，两组的差异有统计学意义（P<0.05）。

时间依赖性抑制,蛋白,时间区间,基因转录

图 1-2 IFN-γ 诱导 RAW 264.7 细胞生成 iNOS 蛋白被 PFT-μ 呈时间依赖性抑制2 iNOS protein expression in IFN-γ-stimulated RAW 264.7 cells was blunted byating cells with PFT-μ (20 μM) for 30 min and then stimulating with IFN-γ (100 ted time points. iNOS and GAPDH were detected by Western-Blot. GAPDH wasan internal loading control. **, P<0.05 versus control (IFN-γ) group, n=3.PS/IFN-γ 诱导 RAW 264.7 iNOS 基因转录可被 PFT-μ 抑制果如图 1-3 所示，real time PCR 检测 iNOS mRNA 水平变化。A 图所刺激的 0 点检测不到 iNOS mRNA 表达，2 小时后 iNOS mRNA 开始时间递增逐渐增强，在试验观察的时间区间内以刺激 8 小时后表达为 100%；PFT-μ 预处理组（20 μM）iNOS mRNA 整体变化趋势与对是表达量较同时间点对照组明显减弱（P<0.05）。B 图所示，PFT-μ50 μM，iNOS mRNA 表达完全被抑制，到 8 小时仍几乎检测不到 iNOS

时间依赖性抑制,炎症因子,未明

30LPS/IFN-γ 诱导 RAW 264.7 细胞 iNOS mRNA 转录可被 PFT-μ 呈时间依3 iNOS mRNA transcription in LPS plus IFN-γ-stimulated RAW 264.7 c by PFT-μ. Pretreating cells with PFT-μ (A,20 μM or B,50 μM) for 30 min ating with LPS (2 μg/ml) plus IFN-γ (100 U/ml) at indicated time points. **versus control (LPS/IFN-γ) group, n=3.S/IFN-γ 刺激 RAW264.7 产生 NO 可被 PFT-μ 抑制要试验结果见图 1-4，组合的炎症因子作用 4 小时内，试验组（PFT NO 生成都未明显增加；8 小时开始，两组中 NO 生成逐渐增加FT-μ 组 NO 产量均低于对照组（P<0.05）。

【共引文献】