NMDA受体主亚基M3M4环自身免疫抗兴奋毒性研究

发布时间：2020-08-24 08:35

【摘要】： N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR，NR)介导的兴奋毒性机制与许多常见的神经、精神疾患，如脑出血、脑肿瘤及脑外伤等引起的癫痫、抑郁、痴呆等有密切关系。已有的NR受体拮抗剂或阻断剂均为人工合成的小分子药物，能弥散通过血脑屏障(空间窗过大)，作用选择性低，病变脑区及非病变脑区都会受到影响，而且由于神经元可逆性损害的“时间窗”极短，人们难以适时使用有效的神经保护药物，这些均导致已有的药物难以进入临床。因此，人们开始探讨新的抑制NR功能的方法，保护性疫苗和抗体治疗在该领域是一种新的探索。本课题主要针对NR主亚基NR1的抗原性、免疫原性及其抗体对兴奋毒性神经元损伤保护作用进行充分的研究论证，为兴奋毒性脑损伤免疫干预提供实验基础。主要实验内容如下：一 NR1激动剂结合区域片段表位分析采用生物信息学方法对人NMDAR主亚基NR1a上两个受体激活相关多肽片段P1(第一跨膜区前)、P2片段(第三、四跨膜域之间)的理化特性与抗原性进行了分析。用GOLDKEY软件分别选取公认的Hopp等与Kyte等亲水性参数、Jain表面可及性参数、Karplus-Schulz主链柔韧性参数及welling抗原性参数对P1、P2两个多肽片段进行参数分析。并采用通用的Prosite程序与Chou-Fasman方法比较分析P1、P2多肽片段的氨基酸位点与二级结构特征。综合判定两个多肽片段的抗原性及其位点，结果认为P2抗原性强于P1。P2片段可能的抗原位点有7个，从氨基端开始依次是FLVLDRPEERI、RLRNPSDKFIYAT、YRHMEKHNYES、RDNKLHAFIW、ASQKCDLVTT、KDSPWKQNVS、ILKSHENGF，分布较均匀，包含有受体激活相关重要位点或与其距离较近。与P1相比，P2更容易成为免疫干预的靶片段。二M3M4环靶片段特异性单抗表位分析为了进一步获得M3M4片段的表位信息，我们以单克隆抗体MAB363(识别表位位于人NRI分子M3M4环)淘筛噬菌体展示随机12肤库，对筛选克隆进行特异性ELISA检测和竞争结合实验分析，从30个克隆中得到一个阳性克隆序列 “VHTN甲sTwQPIL”(克隆1);原核表达的NRI M3M4环可以与克隆1竞争结合 MAB363;结合生物信息学预测结果，固相合成5个表位探针短肤，发现其中只有 R(22)L RNpsKD可以与M3M4环竞争结合抗体，将NPs三个氨基酸残基逐一敲除，缺失N或NP的合成肤和M3M4环竞争抗体的能力减弱，缺失N甲S的合成肤完全没有竞争能力。提示N[PS可能是NRI膜蛋白M3M4环靶片段上一个重要的B细胞表位(主表位)，其序列或构象特征，特别是其中S残基在原子水平上的某种特征(另两个阳性克隆序列均含有SPPL残基)，可能为生物信息学预测表位 RLRNI〕SD昨工YAT以及噬菌体展示肤vHTNPSTwQPIL的免疫反应原性所必需。三M3 M4片段免疫应答检测及抗血清的抗兴奋毒性作用与机制探讨 (一)M3M4片段免疫应答检测为研究M3M4的免疫原性并制备抗血清，M3M4重组肤(100卜g/只)多点注射免疫Balb/C(H一2‘)小鼠，初次免疫时加福氏佐剂乳化分别于第4周和第6周加强。流式细胞仪测定脾细胞CD4+、CDS寸淋巴细胞亚群，间接ELISA测定血清Thl细胞因子几一2、TN下一a和『N一Y，Th一2细胞因子几一4、IL巧和几一6的水平，同时检测特异性抗体产生情况。第6周和第8周CD4+、CDS’T淋巴细胞的百分率与对照组相比都有显著性的增加(P0.01)尤其是CDS+T淋巴细胞的百分率有更明显的增加，CD4十/C DS‘比值降低。初次免疫后4w+ld血清细胞因子有显著变化，其中TN下一。、IFN一Y、IL一4、几一6明显增加，与对照组之间有显著性差异，说明小鼠机体内产生了细胞免疫和体液免疫反应。初次免疫后第5周开始可以检测到抗M3M4工gG抗体，以后抗体水平开始升高，于第8周达到高峰，抗血清滴度为l:100。，抗血清还可以结合合成肤NPS，证明该表位具有免疫原性和抗原性。收集抗血清用于功能检测。 (二)M3M4片段抗血清抗兴奋毒性损害作用以台盼蓝染色法和原位末端标记(TUN’EL)法观察抗血清对原代培养海马神经元兴奋毒性坏死和凋亡的保护效应。结果，在高浓度谷氨酸(500 0 mol/L)条件下，抗血清可以使神经元坏死减少16%;在低浓度谷氨酸(50卜Inol/L)作用下，抗血清保护可使神经元凋亡率减少13%。说明NMDA受体重组肤免疫抗血清具有抗兴奋毒性损伤的作用。以上研究为免疫防治兴奋毒性脑损伤策略的建立提供了坚实的体外实验基础。 (三)单克隆抗体拟B363抗兴奋毒性损害作用琳B363识别表位位于主亚基NRI重要功能区附近，为了了解其是否对兴奋毒性脑损害有保护作用，通过检测神经细胞存活率(台盼蓝拒染法)和细胞培养上清乳酸脱氢酶漏出量以及细胞形态学、凋亡率观察，结果发现，0.妙mo1/’L的单抗琳B363可以明显提高神经元抗谷氨酸兴奋毒性损伤能力，细胞存活率提高41%; 乳酸脱氢酶漏出量减少25%;抗体表位合成肤可以阻断这种保护，提示该抗体的表位是一个受体功能拮抗靶点。 (四)单克隆抗体以B363抗兴奋毒作用机制探讨 (1)探讨抗体保护与神经元钙离子内流的关系。通过激光共聚焦方法来观察细胞内钙离子浓度变化，结果，体外培养12天的
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392

【参考文献】