肩峰下滑囊间充质干细胞多能性的探讨及PEDF蛋白在成骨分化过程中的作用

发布时间：2020-08-28 14:41

　　间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）具有分化为多种细胞的潜能。这个特性使得MSC在再生医学领域中成为研究热点。但是MSC缺乏特定的标记，所以对于MSC的生物学特性，目前了解的还不是很透彻。在骨髓，肌腱，脂肪以及滑膜等组织都可以分离得到MSC，细胞来源的广泛性使得MSC成为一种非常有吸引力的治疗资源。将MSC应用到再生医学的研究，首先就需要将MSC从特定组织得到的细胞混合物中分离出来。大量的研究发现了MSC表面的一些标记，包括CD44，CD73，CD105等，但是这些表面标记并不是MSC所特有的。特异标记的缺乏在一定程度上限制了MSC的鉴定与分离，因此，目前的研究中，研究者们通常联合使用几个表面标记来鉴定MSC，从而克服鉴定困难。再生医学研究中，利用干细胞疗法修复或再生组织的研究已经取得了很大的进步。据报道，MSC可以接种到支架结构或是受一些因子刺激后移植到动物体内，可以诱导或促进组织或器官的修复和再生。肩袖损伤是一种常见的临床疾病，由过度使用和年龄老化等原因引起。通过支架材料以及以细胞为基础的治疗肌腱修复的生物学方法也正在研究开发过程中。以骨髓间充质干细胞和肌腱干细胞为基础的修复和再生肌腱的生物学疗法是目前研究相对较多的。但是由于这两种细胞分离的有限性，限制了这两种细胞在肌腱损伤修复方面的应用。因此，我们认为与肩袖肌腱连接的肩峰下滑囊组织的细胞可能会是肌腱修复的种子细胞，更利于肌腱的修复和再生。体内外实验评测我们在肩峰下滑囊组织分离得到的细胞的多能性。细胞来源于手术废弃物的肩峰下滑囊组织。基于上述假设，在本研究中采集肩袖损伤患者病组织，并将该组织用胶原酶和中性蛋白酶消化为单个细胞悬液，培养及分化结果证明从该组织分离的细胞具有向成骨、成脂、成软骨以及肌腱细胞系的潜能。流式细胞术检测结果也表明该细胞表面含有MSC表面标记，细胞是间充质干细胞的亚群。体外BMP12处理细胞后，细胞表达肌腱组织相关的标记基因，细胞形态呈有序的平行状。用BMP12体外处理细胞并接种到HA/TCP支架结构上，然后移植到小鼠体内可以形成范围较大的骨组织以及肌腱样组织。通过组织学分析和DMP1的免疫荧光染色鉴定骨组织的形成，结果显示肩峰下滑囊组织的细胞在体内形成的肌腱样组织呈平行的，波浪形的胶原纤维束状，这是肌腱组织的典型结构特征，而未用BMP12处理的肩峰下滑囊组织间充质干细胞在支架结构上形成了成纤维软骨组织。本研究第一次证明肩峰下滑囊组织来源的细胞在体内具有成骨、成纤维软骨、成肌腱样组织的潜能，表明该细胞可以在肌腱组织工程的应用方面发挥作用。骨组织疾病也是极为常见的临床疾病，其中，骨质疏松是最为常见的骨组织疾病。骨组织疾病主要是由于营养不良，癌症，感染或遗传以及外界因素造成的，而且几乎所有的骨疾病的发病机制都是由于骨吸收与骨形成的不平衡所导致的，发育阶段的骨组织易骨折的状况也是这个原因引起的。成骨发育不全是一种遗传性疾病，在不明原因的情况下经常发生骨折状况，患有该病的小孩被称为“玻璃孩”。色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derivedfactor，PEDF）是一种潜在的具有抗血管生成作用的因子，广泛存在于各种组织。研究表明，PEDF的缺乏是成骨发育不全症的一个标记，PEDF的突变也会导致成骨发育不全症。因此，本研究将探索PEDF在人间充质细胞内的作用及其作用机制。结果表明，含有PEDF的细胞维持液培养的细胞表达成骨细胞相关的基因，在第14天，该培养液培养的细胞表现出ALP活性；另外，在含有PEDF的成骨诱导液内培养的细胞的ALP活性相对于只有成骨分化液诱导的细胞组提高了19%（35.655±1.827U/mg蛋白, P=0.0.041VS29.956±2.100U/μg protein）。通过茜素红定量研究发现，含有PEDF的成骨诱导液培养的细胞形成的钙沉积水平比单独的成骨诱导液培养的细胞组高50%以上（2.108±0.306OD/ml/well/1x104cells/cm2，P=0.017VS1.398±0.098OD/ml/well/1x104cells/cm2）。PEDF特异的siRNA抑制MSC的PEDF表达水平后，ALP活性也下降（PEDFsiRNA组:33.552±2.009U/ng蛋白VS对照siRNA组39.269±3.533U/ng蛋白, P=0.039），同时钙沉积水平也显著降低（PEDF siRNA组：0.654±0.050OD/ml/per well/1x104cells/cm2VS对照组：1.152±0.132OD/ml/well/1x104cells/cm2, P=0.010），外源的PEDF蛋白可以部分恢复ALP活性和钙沉积水平。在人的MSC细胞内，PEDF通过激活ERK和AKT信号通路诱导成骨分化相关基因的表达。这些数据表明，PEDF参与人MSC的成骨分化过程，主要影响细胞的钙沉积水平。综上所述，人类肩峰下滑囊间充质干细胞（HBDMSC）在以MSC为基础的治疗肌腱损伤相关疾病方面具有巨大的潜能，是促进肌腱修复和再生的种子细胞。在人的MSC中，PEDF通过ERK和AKT信号通路调控成骨细胞分化进程，尤其是钙沉积水平。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

间充质干细胞,骨髓间充质干细胞

图 1-1 间充质干细胞的分化潜能Figure 1-1 The potential differentiation of Mesenchymal Stem Cells.1.3.3.1 骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞在再生医学的应用方面，是应用最广泛的一种细胞。骨基质以及造血系统形成了骨髓这样的一个结构（图 1-2 ，tp://stemcells.nih.gov/info/2001report/pages/chapter5.aspx）。骨髓基质含有的细胞类型包括，成骨细胞，破骨细胞，成纤维细胞，巨噬胞，脂肪细胞以及内皮细胞。而在造血系统中主要含有的组织就是髓体，在血生成中发挥作用。显而易见，这两部分是不同的；但是不能割分他们之间互影响，相互作用的关系。骨髓基质间接参与血细胞生成，在这过程中他的用是在分化为血细胞的过程中提供机械支持的作用，同时表达一些细胞的信[29]

谱系,基质干细胞,造血干细胞

造血干细胞（HSCs）也是在骨髓中分离得到的。是自上世纪 50 年代开始研究最广泛，也是特征最透彻的成体干细胞。这些未分化的细胞具有干细胞的自我更新能力以及多能性的特性。另外，这些细胞还可以按照有序的规律进行迁移并通过凋亡的方式被调控。HSCs 是可以分化为所有类型的血细胞包括粒细胞的血细胞，如单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，红细胞，血小板，和树突状细胞，以及淋巴谱系的 T 细胞，B 细胞，NK细胞（参见图 1-2，http://stemcells.nih.gov/info/2001report/pages/chapter5.aspx）[30]。HSCs 也能分化为间充质组织的细胞包括肌肉和脑细胞。HSCs 表达 CD14，CD31，CD38，CD45 和 CD133。而在骨髓中分离到的其它的成体干细胞也会表达其中的一些表面标识。几十年来，通过手术移植的方法将 HSCs 用于癌症，再生障碍性贫血，地中海贫血，镰刀状细胞贫血症，成骨不全症，自身免疫性疾病等疾病的治疗。

干细胞,祖细胞

[49]。该图是一个干细胞正在分裂的过程。干细胞可以分裂为子代干细胞也可以分裂为特化的祖细胞。这些祖细胞具有一些干细胞的分裂以及分化的能力，但是这些特征不像干细胞那么强。他们最终都会成为特化的细胞[49]。与 ESC 相比，大多数的 MSC 只能在有限的复制代数中保持它的干性。MSC 的增殖效率在某种程度上比大多数细胞高，但是最终也不会逃脱衰老的命运。只有一小部分细胞在培养过程中可以具有长期的自我更新的能力[50,51]。“在人类以及小鼠的干细胞中，干细胞的自我更新能力会随着年龄的增长，尤其是在受到压力的状况下而减弱”[52]。在成体组织中分离到处于静态的 MSC 通常都很少[53]。这些细胞大多数都不是明显的处于 G0 期，而是在向 G1 期缓慢的前进[52]。例如，Friedstein 实验室研究结果显示在 105的骨髓间充质干细胞中只有一个细胞具有形成于骨髓基质相关的祖细胞的克隆[21,54,55]。在脂肪组织中，每 105个细胞，有一个是潜在的 MSC。而这个问题可以通过增大组织的基数以及体外培养扩增细胞得到解决。

【共引文献】