稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌大鼠模型的建立及栓塞对肝癌肺转移影响的实验研究

发布时间：2020-08-31 16:45

　　第一部分稳定表达绿色荧光蛋白的McA-RH7777细胞株的建立及生物学特性评价目的：构建稳定表达绿色荧光蛋白的McA-RH7777细胞株,并对其生物学特性进行评价。方法：通过对慢病毒载体包装,将携带增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluores-cent protein, EGFP)的慢病毒转染McA-RH7777细胞株,并进行筛选和单克隆化,构建出表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞株：McA-RH7777/EGFP。体外多次传代后检测该细胞株荧光表达的稳定性；对McA-RH7777和McA-RH7777/EGFP两种细胞株在细胞生长、细胞周期、迁移运动能力、侵袭能力、AFP的表达及体内成瘤方面进行观察,判断经慢病毒转染后构建的细胞株较McA-RH7777细胞株的生物学特性是否改变。结果：通过慢病毒载体介导转染McA-RH7777细胞株实验过程顺利,经过筛选和单克隆化建立的McA-RH7777/EGFP细胞株,能够体外稳定表达绿色荧光蛋白。经过180天体外培养后,仍能稳定表达绿色荧光,流式细胞仪检测表达率达到100%；细胞形态较转染前未发生改变。McA-RH7777/EGFP细胞株的生长曲线、细胞周期、迁移运动能力、侵袭能力、AFP的表达与McA-RH7777细胞株基本一致。将McA-RH7777/EGFP细胞注入Buffalo大鼠皮下,建立皮下瘤,显示成瘤率、肿瘤生长趋势与McA-RH7777细胞基本一致。结论：通过慢病毒载体介导的转染方法建立起来的McA-RH7777/EGFP细胞株能稳定表达绿色荧光蛋白,细胞生物学特性与母系细胞株基本一致,为肝癌的基础研究提供了一个良好的细胞株。第二部分稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌大鼠模型的建立及相关特性评价目的：建立稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌大鼠移植瘤模型,并评价该模型的生物学特性,为肝癌的转移和复发、介入治疗等研究提供一个重要的动物模型。方法：利用McA-RH7777/EGFP细胞株皮下注射成瘤后,制备瘤块。取30只Buffalo大鼠,开腹直视下,将瘤组织块种植到肝脏。造模后第7天行MRI扫描检查肝内成瘤率。观察荷瘤鼠的生物学特征变化,了解其转移特性；在小动物成像仪及荧光显微镜下观察荧光表达的稳定性及评价荧光在肿瘤转移复发研究中的优势；病理学及免疫印迹分析观察肿瘤组织特点及肿瘤指标的表达情况；行MRI、CT、DSA检查来评价该肿瘤模型的影像学特点。结果：该模型造模成功率高,达到100%。大鼠生存期为45.93±5.06天。大鼠肝内肿瘤体积第7天时为12.54±3.89mm3,14天时201.18±86.39mm3,较前明显增大,之后增长迅速。终末期观察该肝癌模型具有高肺转移特性,肿瘤组织荧光表达稳定,在荧光显微镜下可以清楚的区分肿瘤病灶,病理符合肝癌表现。AFP表达阳性。肿瘤在MRI上T1WI上成像稍低或等信号,而在T2WI上呈高信号;CT显示肝内病灶为低密度,肺部多发结节状转移灶；DSA造影显示肝内肿瘤供血动脉增粗,血管扭曲,肿瘤染色明显,与人类肝癌影像学表现相似。结论：稳定表达EGFP的肝癌Buffalo大鼠移植瘤模型和人类的肝癌的生物学特性接近,具有成瘤率高、重复性强、高肺转移等特性,荧光表达稳定,适合用于肝癌转移和复发、介入治疗、影像诊断、新药筛选等方面的实验研究。第三部分大鼠移植性肝癌模型肿瘤分期的初步探讨目的：通过观察稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌Buffalo大鼠模型肿瘤的进展过程,确定大鼠肝癌模型的肿瘤分期,探讨微转移期的时间窗。方法：利用McA-RH7777/EGFP细胞株皮下注射成瘤后,制备瘤块。取35只Buffalo大鼠,开腹直视下,将瘤组织块种植到肝脏,造成大鼠肝癌模型。观察大鼠的生物学行为,并根据该模型的生长特点及大鼠肿瘤的进展情况,于7、12、18、21、26天分别处死7只大鼠,利用肿瘤细胞表达荧光的特点,在荧光显微镜下准确的观察肝内肿瘤生长情况、肺转移情况。在处死大鼠时取下腔静脉血,流式细胞仪检测大鼠循环肿瘤细胞的变化,并检测肝功能中白蛋白的变化。通过综合上述因素,来确定大鼠的肿瘤分期。结果：造模后7天,行MRI扫描,Buffalo大鼠肝内均有肿瘤,造模成功。造模后大鼠体重7天内增长不明显,之后开始增加；至21天体重增加不明显,随后开始下降。肝内肿瘤第7天时为13.36±2.90mm3,12天时162.5±69.71mm3,26天达到1683.36±375.02mm3。观察肝外转移情况：21天时肺部出现荧光显微镜下可见的小转移灶,之前肺部未见转移灶；26天时肺部出现肉眼可见多发小转移灶。循环肿瘤细胞检测发现：第7天未能检测到肿瘤细胞,12天肿瘤细胞数为(8.14±1.21)/106,18天时肿瘤细胞数为(15.43±3.99)/106,P0.05。肝功能检测发现26天时ALB为28.8±2.85g/L,较前下降,P0.05。结论：在稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌Buffalo大鼠模型上从12天到18天可定义为微转移期肝癌,21天后为晚期肝癌。该分期情况可以为肝癌的动物实验研究提供一定的参考。第四部分经动脉栓塞术对微转移期肝癌肺转移影响的实验研究目的：对微转移期的肝癌大鼠进行经动脉栓塞治疗,探讨栓塞治疗对于该时期肝癌肺转移的影响,并对其机制进行初步研究,为临床更科学的设计治疗方案提供参考。方法：取40只Buffalo大鼠,开腹直视下,将瘤组织块种植到肝脏,建立稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌大鼠模型。造模后第17天,将大鼠随机分成4组,每组10只,分别为：对照组(A),开腹胃十二指肠动脉逆行插管成功后,注入生理盐水0.2ml;肝动脉结扎组(B),分离肝动脉后采用缝线结扎；小剂量栓塞组(C),胃十二指肠动脉逆行插管,注入超液化碘油(0.2ml/kg)；大剂量栓塞组(D)：胃十二指肠动脉逆行插管,注入超液化碘油(0.4ml/kg)。术后随访体重及肿瘤变化,三周后处死所有大鼠,收集肝和肺标本,观察肿瘤生长变化及肺转移情况。通过进行Real time PCR、Western-blot、免疫组化来检测肿瘤组织中的VEGF、 E-cadherin、ICAM-1在mRNA及蛋白水平表达的差异。结果：术后第7、14、21天,记录肝内肿瘤情况显示：D组明显抑制肝脏肿瘤生长,B、C组相对于对照组也有抑制生长。观察肺转移：D组肺转移个数相对较少。通过RT-PCR比较各组VEGF mRNA的相对表达量：B、C、D组的VEGF mRNA相对表达量,分别为2.53±0.28、2.46±0.32、1.95±0.17,均较A组(0.93±0.29)表达量高,有统计学意义,P0.05。Western-blot分析VEGF结果显示：A组为0.17±±0.01,较B(0.28±0.05)、C(0.27±0.07)、D(0.21±0.04)三组表达低,有统计学差异,P0.05。免疫组化染色记录阳性细胞数百分比显示A、B、C、D四组分别为：46.8±6.05、63.8±7.09、61.3±3.82、51.4±4.5,相互比较发现：A组较B、C组低,P值均小于0.04；但A、D之间无显著差异,P0.05。肿瘤内CD31标记的阳性血管数显示：B(57.1±6.9)、C(52.3±2.7)组较A(43.3±3.7)、D(45.5±3.5)组高,有统计学差异,P0.05。通过RT-PCR分析四组E-cadherin mRNA的相对表达量：D组(1.66±0.38)较A(0.99±0.39)、B(0.80±0.23)、C(0.86±0.24)三组表达增高,均有统计学意义,P0.05。Western-blot分析E-cadherin结果显示A、B、C、D四组分别为：0.13±±0.06、0.12±0.04、0.13±0.03、0.32±0.09,D组较A、B、C三组高,有统计学意义,P值均小于0.003。免疫组化染色计数阳性细胞率发现结果同Western-blot结果相似。通过RT-PCR分析ICAM-1mRNA的相对表达量显示A、B、C、D四组分别为：1.09±0.19、1.12±0.16、0.97±0.23、0.69±0.16,D组较其他三组降低,P0.05。Western-blot分析ICAM-1结果显示：D组(0.27±0.05)较A(0.41±0.08)、B(0.44±0.09)、C(0.40±0.06)三组降低,P0.05。结论：在大鼠肝癌模型上,经动脉栓塞治疗微转移期肝癌,大剂量的碘油栓塞能抑制肿瘤生长,降低肺转移。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R735.7;R445.2;R-332

【参考文献】