脱氧核酶抗呼吸道合胞病毒效应的体外研究

发布时间：2020-09-03 10:14

　　 背景与目的 呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最重要的病毒病原。RSV还是婴幼儿猝死综合征的主要病因以及院内感染的主要病原体和成人急性呼吸道感染的病原之一。目前尚无安全有效的疫苗和药物控制RSV感染。RSV为一负链RNA病毒，其序列已清楚。RSV基因组RNA上的某些序列的完整性对病毒复制极为重要。RSV复制须首先合成RNA中间产物，在某些区域内切断基因组RNA，可使中间产物RNA无法产生从而阻断RSV复制。已有作者证实在基因组RNA NS2基因片段内磷酸二酯键部位进行切断可有效阻断RSV复制。RSV可以基因组负链RNA为模板，依靠病毒自身携带的RNA聚合酶转录mRNA，再将mRNA上的遗传信息翻译为病毒蛋白。选择适合的位点分解RSV的mRNA可阻断某些病毒蛋白的合成。 脱氧核酶(DNAzyme/Deoxyribozyme)是继核酶（Ribozyme）之后又一种崭新的分子生物学工具。脱氧核酶由具有RNA内切酶活性的碱基环和根据靶RNA序列设计的两条侧臂构成。侧臂可通过碱基互补原则高度特异地将碱基环固定到靶位点上，并在一个未配对的嘌呤 WP=8 和一个已配对的嘧啶之间将靶RNA切断。目前，脱氧核酶的应用研究在病毒感染性疾病、肿瘤、心血管疾病以及遗传性疾病等方面已取得不同程度的进展，但有关脱氧核酶抗RSV感染的研究尚未见报道。 本研究针对RSV基因组RNA以及mRNA的不同位点，设计合成抗RSV脱氧核酶，观察其在细胞培养系统内的抗RSV效应，为使用脱氧核酶控制RSV感染提供理论依据。 方法 以Santoro等报告的10-23脱氧核酶为核心，针对RSV NS2基因起始区设计3个脱氧核酶：DZ595、DZ604和RSV2UDZ（NS1-2）；针对RSV M2mRNA设计3个脱氧核酶：DZ8269、DZ8277和DZ RSV2UDZ（M2）并在无细胞系统中进行筛选。以猴肾细胞Vero为RSV繁殖细胞，选择人气道上皮细胞9HTE为RSV的靶细胞，观察RSV在人气道上皮细胞株9HTE细胞中的致细胞病变效应，建立稳定的RSV感染的细胞培养系统。使用经无细胞系统筛选证实具有底物切割活性的脱氧核酶DZ604，在RSV感染的9HTE细胞培养系统中分别观察：脱氧核酶对RSV致9HTE细胞病变的影响；脱氧核酶对RSV空斑形成的阻断效应；脱氧核酶对RSV所致的细胞超微结构变化的影响；脱氧核酶对RSV所致的细胞周期变化的影响；四唑盐（MTT）比色试验检测不同浓度脱氧核酶对RSV感染的9HTE细胞的保护效应；酶联免疫吸附试验检(ELISA)测脱氧核酶对RSV蛋白表达的影响；脱氧核酶、脱氧核酶突变体（mRDZ）、非特异性脱氧核酶以及利 WP=9 巴韦林抗RSV效应的比较；脱氧核酶抗麻疹病毒效应以及脱氧核酶对9HTE细胞的毒性作用。 结果 DZ595、DZ604和RSV2UDZ（NS1-2）均能切割RSV NS1/2RNA底物，以DZ604的作用最强；DZ8269和DZ8277能切割RSV M2mRNA底物，RSV2UDZ（M2）未显示底物切割活性；抗RSV基因组RNA脱氧核酶不能切割RSV M2mRNA底物；抗RSV M2mRNA脱氧核酶不能切割RSV NS1/2RNA底物。 我们成功建立了稳定的9HTE细胞培养系统：RSV感染9HTE细胞后可出现明显的细胞病变，以细胞圆缩脱落为主，融合性病变较少；病变出现的早晚和病变的程度与MOI有密切关系，当MOI为10、1时，感染细胞在12小时内迅速圆缩脱落并很快裂解死亡，当MOI逐渐减小时，细胞病变出现的时间则越来越晚，全部细胞均发生病变的时间也越来越长，当MOI为0 0001时，细胞在感染5天后才出现病变，全部细胞均发生病变则在感染12天后。脱氧核酶在RSV感染的9HTE细胞培养系统内的抗病毒效应：脱氧核酶对RSV所致细胞病变的改善作用与RSV的感染量有关，同一浓度脱氧核酶（5μmol /L），当RSV感染量较大（MOI = 10，1）时，其改善细胞病变的作用不明显；当RSV感染量较小（MOI = 0 1,0 01,0 001,0 0001）时，脱氧核酶可明显改善RSV所致的细胞病变，治疗组病变出现时间和完全病变时间延迟，随着MOI的逐渐减小，效果逐渐增强（P 0 05）。当脱氧核 WP=10 酶浓度为5μmol/L时，RSV减少的百分率可达85 56%，当脱氧核酶浓度降低至0 25μmol/L时，RSV减少的百分率仅为8 33%，脱氧核酶对病毒抑制效应与其浓度有关，浓度越高，效果越明显(P 0 05)。细胞感染RSV后发生 G0-G1期阻滞，S期细胞数减少，随着感染时间的延长，G0-G1期阻滞进一步加剧，S期细胞数继续减少，G2-M期也受到影响而开始减少，细胞周期FACS分析表明，脱氧核酶可不同程度逆转RSV感染所致的细胞周期变化（P0 01）。脱氧核酶浓度为5μmol/L时，细胞存活率达81 91%，当脱氧核酶浓度降至0 25μmol/L时，细胞存活率为50 45%，脱氧核酶能提高细胞感染RSV后的存活率，浓度越高，细胞存活率越高（P 0 001）。脱氧核酶浓度为5μmol/L时，其RSV抑制率是72 01%，当脱氧核酶浓度降至0 25μmol/L时，RSV抑制率为23 33%，脱氧核酶浓度与RSV抑制率之间存在剂量依赖关系，浓度越高，对RSV的抑制作用越强（ P 0 05）。脱氧核酶显著降低RSV的蛋白表达，即使浓度为0 25μmol/L时，脱氧核酶对RSV蛋白的产生仍有明显抑制作用，脱氧核酶的浓度越高，RSV蛋白的产量越低（P 0 05）。MTT比色试验显示，当MOI为0 01时，利巴韦林的最低有效浓度为100μmol /L，是脱氧?
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2002
【中图分类】：R346
【部分图文】：

RNA体外转录流程示意图过程

图 1-5 抗 RSV 脱氧核酶在无细胞系统中对 RSV RNA底物的切割实验,A 为脱氧核酶V 基因组 RNA 底物 NS1/2RNA 切割结果 B 为脱氧核酶对 RSV M2mRNA 底物 M2RN切割结果Fig.1-5 Cell free assay of DNAzyme cleavage for RSV RNA substrate , A. DNAzymeavage for RSV NS1/2RNA substrate B. DNAzyme cleavage for RSV M2mRNA substrate由图 1-5-A 可见 3 个抗 RSV 基因组 RNA 脱氧核酶均能切割 R1/2RNA 底物 以 DZ604 的作用最强 抗 RSV 基因组 RNA 脱氧核不能切割 RSV M2mRNA 底物 由图 1-5B 可见 3 个抗 RSV M2mR氧核酶中 DZ8269 和 DZ8277 能切割 RSV M2mRNA 底物 RSV2UM 2 未显示底物切割活性 抗 RSV M2mRNA 脱氧核酶不能切割 R1/2RNA 底物

图 2-2 RSV致 9HTE 细胞病变效应的观察A 正常 9HTE 细胞 ×100B H 不同程度的细胞病变 B G ×100 H×250Fig. 2-2 Cytopathogenic effect(CPE) of 9HTE cells induced by RSV infectionA Normal 9HTE cells ×100B H CPE of 9HTE cells in different extent, B G ×100 H×250图 3-2脱氧核酶对 RSV 致 9HTE细胞病变效应的影响A 正常 9HTE 细胞×100A1 RSV 感染的 9HTE细胞,×100,MOI=10B1 RSV 感染+DZ 处理的9HTE 细胞×100 MOI=10Fig.3-2The action of DZ on CPE of

【引证文献】

相关博士学位论文 前1条

1 俞海国;ICAM-1和NF-κB在RSV感染中的作用及10-23型脱氧核酶体外抗RSV效应的实验研究[D];重庆医科大学;2003年

本文编号：2811294