DNMT1和CLM-3在天然免疫应答中的功能及机制研究

发布时间：2020-09-16 20:27

　　 DNA甲基转移酶是一种在原核和真核生物高度保守的酶,能够在基因组中的DNA复制后对其胞嘧啶C5位点进行修饰,参与体内多种重要生理过程,主要包括:调节基因表达、基因印记、维持染色体完整性以及X-染色体灭活等。根据其结构和功能的不同,哺乳动物中DNA甲基转移酶(Dnmts)主要分为两大类: DNA甲基化维持酶Dnmt1以及DNA从头甲基化酶Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L等. 树突状细胞(dendritic cells，DC)是指具有树枝状突起和星状多形性，高表达MHCI类和I类分子，能有效摄取、加工和处理抗原并激活初始型T细胞的一类抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)。DC是1973年由Steinman和Cohn首先发现的。作为目前发现的功能最强的APC，DC最大的特点是能够刺激初始型T细胞(naive Tcell)活化和增殖。DC是抗原特异性免疫应答的始动者，由于其在免疫应答中的独特地位，对DC的研究有助于深入了解机体免疫应答的产生和调控机制，对肿瘤、移植排斥、感染、自身免疫性疾病等的发生发展机制的认识有重要的理论意义。免疫球蛋白超家族含有众多的膜上和膜内受体,参与天然免疫和获得性免疫中的各种免疫应答反应.小鼠CMRF-35样分子家族为免疫球蛋白超家族的成员之一.CLM家族成员在识别不同的配体后能够正向或负向调控免疫应答反应。本实验室通过小鼠树突状细胞cDNA文库大规模测序后，发现了一系列选择性地在树突状细胞和巨噬细胞等抗原提呈细胞上表达的CLM家族成员受体，包括树突状细胞来源的免疫球蛋白受体1(DC-derived Ig receptor1, DIgR1)/CLM-4,树突状细胞来源的免疫球蛋白受体2(DC-derived Ig receptor2, DIgR2)/CLM-1, CLM-5，以及本文中研究的CLM-3。抗原递呈细胞能够通过模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)来检测入侵宿主的病原微生物，然后促发免疫球蛋白超家族含有众多的膜上和膜内受体,参与天然免疫和获得性免疫中的各种免疫应答反应。活化的天然免疫细胞能够诱导促炎因子和I型干扰素的产生来清除入侵的病原微生物。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)作为模式识别受体中最重要的一种，显著高表达于抗原递呈细胞，包括巨噬细胞，单核细胞以及树突状细胞。根据所有TLRs家族成员的亚细胞定位，TLRs分成两大类：细胞膜定位的TLRs和细胞内定位的TLRs。在所有TLRs中，内体定位的TLR9是唯一一种能够识别病原体来源DNA的TLR。一旦结合细菌中含有CpG岛的DNA或者人工合成的含有为甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)，TLR9就能够直接活化抗原递呈细胞和天然免疫细胞分泌各种促炎因子。当CpG-ODN结合到TLR9时能够招募接头分子MyD88，进而激活下游MAPKs和NF-κB的磷酸化信号通路，最终引起促炎因子和I型干扰素的产生。研究证实TLR9的激动剂能够诱导强烈的Th1型免疫反应来保护宿主免受细菌和病毒的感染。因此，对于如何选择性的活化TLR9信号来起始保护性免疫应答及TLR9完全活化的潜在机制仍需进一步研究。基于以上研究进展和现状分析，我们利用现代实验技术对人单核细胞来源的树突状细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中的DNMT1在天然免疫应答方面的功能进行了研究；同时对于CLM-3对于Toll样受体的功能影响进行了深入的探讨。第一部分人单核细胞来源的树突状细胞中与DNMT1相互作用蛋白的探讨随着小鼠骨髓来源树突状细胞在免疫应答中功能研究的深入，我们开始关注人单核细胞来源的树突状细胞的功能。作为重要的DNA甲基转移酶DNMT1功能的不断发现，使得我们开始探寻DNMT1在人单核细胞来源树突状细胞中的作用。我们使用蛋白质免疫共沉淀技术、质谱兼容银染以及LS-MS/MS的手段，发现了一系列在人单核细胞来源的树突状细胞中与DNMT1相互作用的蛋白，这些蛋白主要集中在翻译起始因子eIF家族，主要包括eIF3A、eIF3H；以及细胞周期和凋亡调节蛋白1（cell cycle and apoptosis regulator protein1, CARP1)。鉴于目前的研究报道，DNMT1主要是在核内发挥其对DNA的甲基化修饰功能，而eIF3A和eIF3H则主要是在胞浆中发挥蛋白的翻译。这就促使我们去探寻DNMT1是否在胞浆中也发挥其非经典功能，而参与了其他一些生物学功能。通过免疫共沉淀，我们发现了DNMT1确实存在于胞浆中，而且能够与同在胞浆中发挥作用的eIF3A和eIF3H相互结合，而在胞核中则为发现eIF3A和eIF3H与DNMT1的结合。对于DNMT1在胞浆中具体发挥怎么样的功能还有待于进一步的深入探讨。对于同期发现的细胞周期和凋亡调节蛋白CARP1，研究发现DNMT1与CARP1两者之间主要在细胞核内相互作用，这提示我们CARP1可能参与了DNMT1的经典功能，作为一个新的可能参与DNA甲基化的蛋白，其具体功能有待于进一步深入的研究。第二部分DNMT1在巨噬细胞天然免疫功能中的作用研究 TLR是研究最早的模式识别受体，其在激活机体的固有免疫应答和调控获得性免疫应答，抵御各种病原体感染中发挥重要的作用。它的活化不足导致机体不能有效地清除病原体，而过度的激活又会引发一系列的免疫损伤如脓毒症休克等。因此TLR信号通路必须受到严格的精密调控，TLR信号通路同其他信号通路之间的交叉联系也是近年来免疫学的研究热点之一。对于DNA甲基转移酶DNMT1在TLR信号通路中的作用还没有相关的研究报道，我们通过干扰小鼠腹腔巨噬细胞中的DNMT1后，用各种TLR配体进行刺激，进而研究DNMT1是否参与TLR信号通路。研究发现，在DNMT1得到有效干扰后并不能够显著影响TLR3、TLR4以及TLR9活化产生的IFN-beta和TNF-alpha。基于巨噬细胞在抗病毒的过程中也发挥着重要作用，我们观察了干扰DNMT1对于VSV和SeV感染的影响。研究发现DNMT1的干扰能够影响VSV和SeV引起的IFN-beta的产生，DNMT1能够促进IFN-beta的产生，这提示我们DNMT1可能参与RIG-I的信号通路，对于其具体机制，有待于进一步的研究和探索。第三部分CLM-3调控TLR9触发的巨噬细胞天然免疫功能及其机制研究 CLM-3(CMRF-35like molecule3)作为CLM家族成员之一，与CLM-5关系密切，同属于活化性受体。研究表明CLM-5能够通过与含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine based-activating motif， ITAM)的FcRγ相互作用，进而转导活化信号。CLM-3同样也能够与FcRγ相互作用，但是其在天然免疫应答中的功能还未得到确认。本实验室早期的研究发现CLM-3选择性地表达于巨噬细胞中，CLM-3能够通过与MyD88结合以激活MAPK、NFkB通路从而促进了TLR9触发的巨噬细胞产生炎性细胞因子TNFa和IL-6，研究提示，CLM-3与带有ITAM基序的FcRγ相互作用,但是，CLM-3调控TLR9信号通路的具体分子机制尚不清楚。通过研究证实，CLM-3选择性地表达于巨噬细胞中，为内体/溶酶体定位的免疫受体；在TLR9配体CpG-ODN刺激下，CLM-3在巨噬细胞中的表达被下调；CLM-3作为一个能够在巨噬细胞中正向调控TLR9信号转导的受体，主要通过增强TRAF6(TNFR-associated factor6)的泛素化，进而促进下游MAPKs和NF-κB的信号转导，最终使得TLR9引发的天然免疫应答反应全面活化。研究主要发现通过与CLM-3的交互作用能够促进TLR9引发的天然免疫反应，最终有利于宿主清除外来入侵病原体。我们通过激光共聚焦检测发现在Raw264.7细胞系中CLM-3能够与LAMP1阳性的细胞器和早期内体标记Rab5共定位，而对于高尔基体的代表性标记GM130则没有明显共定位。因此，CLM-3不像其他细胞膜定位的CLM家族成员，而是选择性的定位于膜类细胞器内体及溶酶体。从CLM-3在巨噬细胞中定位内体及溶酶体，我们推测CLM-3可能在TLR9触发的巨噬细胞活化过程中发挥作用。我们用CpG-ODN刺激siRNA干扰过的原代腹腔巨噬细胞，发现CLM-3被干扰后降低TLR9活化引起的TNF-α和IL-6表达，但是不影响Poly(I:C)或LPS引起的TNF-α和IL-6的表达。因此，我们证实CLM-3能够选择性地促进TLR9，而非TLR3或TLR4，引起的促炎因子的产生。为验证CLM-3过表达在体内的作用,我们制备了CLM-3转基因小鼠(CLM-3transgenic mice, CLM-3TG mice)观察CLM-3在TLR9触发的天然免疫应答。Westernblot证实在原代腹腔巨噬细胞中高表达带HA标签的CLM-3。取自CLM-3TG mice的巨噬细胞相较于同窝未表达HA-CLM-3的小鼠的巨噬细胞，在CpG-ODN刺激后能够产生更多的TNF-α和IL-6，实验结果和在巨噬细胞中过表达CLM-3的效应相一致。在小鼠腹腔注射CpG-ODN后，观察血清中TNF-α和IL-6的表达水平也得出相似的结论，CLM-3TG mice较同窝对照小鼠产生更多的炎症因子。鉴于在浆样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)中TLR9在I型干扰素的产生过程中发挥着重要作用，我们观察了从转基因小鼠脾脏来源的pDC在GpG-ODN刺激后诱导产生I型干扰素中的效应。研究发现CLM-3转基因小鼠和同窝对照小鼠来源的pDC在干扰素的产生上并无显著性差异。研究证实CLM-3作为一个能够正向调控TLR9触发的天然免疫应答主要在巨噬细胞中发挥作用。已有研究报道证实，MAPKs和NF-κB是CpG-OND触发细胞因子产生的关键信号通路。在CLM-3转基因小鼠来源的巨噬细胞中，我们观察到CLM-3的过表达能够促进ERK1/2，JNK1/2，以及p38的磷酸化水平，相同的作用趋势发现在CLM-3过表达的Raw264.7细胞系中。在体外检测CLM-3转基因小鼠来源的腹腔巨噬细胞发现CpG-ODN刺激活化IKKα/β和IκBα的磷酸化水平明显强于同窝对照小鼠。上述实验结果证实，CLM-3能够促进CpG-ODN触发的TLR9信号通路活化。通过前面的实验我们已经证实了CLM-3对于TLR9的正向调控作用，对于潜在的机制研究将使我们对于CLM-3的了解更为透彻。报道证实，CpG-ODN在结合到TLR9后，下游信号分子MyD88能够招募IRAK1(IL-1receptor associated kinase1)、IRAK2以及IRAK4。这些IRAK激酶的活化能够招募TRAF6进行泛素化，进而激活下游的MPAKs和NF-κB信号。TRAF6作为TLR9信号中起关键作用的分子，其泛素化是激活下游信号活化所必需的。因此，我们想证实一下CLM-3的过表达是否会增强TRAF6的泛素化。在原代腹腔巨噬细胞中用siRNA干扰CLM-3后，我们检测了CpG-ODN刺激后TRAF6的泛素化水平，发现CLM-3的沉默能够降低TRAF6的泛素化水平。同理，我们检测了来自于CLM-3转基因小鼠的原代腹腔巨噬细胞，发现CpG-OND刺激后，来自CLM-3转基因小鼠的腹腔巨噬细胞中的TRAF6的泛素化水平高于同窝对照小鼠来源的。在前面的研究中，我们证实了CLM-3定位于内体/溶酶体。所以我们接着探索CLM-3是否能够直接和TLR9、MyD88或TRAF6相互作用。在进行免疫共沉淀实验中，我们发现来自于CLM-3转基因小鼠的原代腹腔巨噬细胞中的CLM-3能够和TLR9发生微弱的相互结合，但是和MyD88或TRAF6则没有相互结合。进一步的实验表明，在CpG-ODN刺激后CLM-3和TLR9之间的结合增强。这些结果提示我们在CpG-ODN刺激的作用下，CLM-3能够和TLR9的结合增强，进而通过促进TRAF6的泛素化来增强TRAF6的活性，最终强化了下游的信号通路，使更多的炎症因子得到表达。通过以上三部分的研究，增进了我们对于天然免疫应答过程的了解，通过研究我们发现在人外周血单核细胞来源的树突状细胞中DNMT1能够与eIF3A、eIF3H以及CARP1相互结合，至于其潜在的作用还有待于进一步的研究。在小鼠腹腔巨噬细胞中观察到的DNMT1能够促进VSV和SeV引起的IFN-beta产生，使得我们明白DNMT1除了发挥其经典的DNA甲基化转移酶作用外，还有可能参与了天然免疫应答。通过研究CLM-3在小鼠巨噬细胞中对于Toll样受体的功能，发现了CLM-3通过促进TRAF6的泛素化增强巨噬细胞中CpG-ODN引起的TLR9免疫应答及机制，以及CLM-3能够在CpG-ODN的巨噬细胞中和TLR9的结合增强。同时发现CLM-3能够增强MAPKs的磷酸化以及NF-κB的活化。上述研究拓宽了我们对于DNMT1和CLM-3分子的性质与功能的认识，丰富了TLR免疫识别及其调控机制的研究内容，也有望为感染免疫和肿瘤的研究与治疗方法的寻找提供新的启示。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R392
【部分图文】：

免疫共沉淀,质谱,蛋白,条带

第二军医大学博士学位论文2 结果2.1 质谱检测分析人外周血来源的树突状细胞中与 DNMT1 相互结合的蛋白基于 Data-base 的研究思路，我们在实验室对人外周血来源的树突状细进行了全基因组甲基化测序以及 RNA 组分析，分析结果显示，与表观相关的甲基化转移酶中，DNMT1 在未成熟的树突状细胞中高表达。这就促使我们去探DNMT1 在未成熟的树突状细胞中具体发挥着怎么样的作用。按照实验方法培养人外周血来源的树突状细胞后，收集半悬浮的 DCs 后DNMT1 的抗体进行免疫共沉淀去寻找潜在的相互结合蛋白。我们采用了质谱银染方法对免疫共沉淀进行了检测（图 1-1）。

树突状细胞,相互作用,抗体

对于 DNMT1 我们采用了两种不同克隆来源的抗体，结果显示，使用不同克隆的抗体得到一直的结果（图1-2 A-B）。图 1-2 在树突状细胞中 co-IP 检测 DNMT1 与 eIF3A、eIF3H 及 CARP1 的相互作用。Figure 1-2 Co-IP detected the interaction between DNMT1 and eIF3A, eIF3H,CAPR1 in DCs.

胞浆,胞核,树突状细胞,甲基化转移酶

DNMT1 和 CLM-3 在天然免疫应答中的功能及机制以往的报道证实，DNMT1 主要在细胞核内发挥 DNA 甲基化转移酶的作用[41]而 eIF3A 和 eIF3H 则主要在胞浆中发挥蛋白翻译起始复合体组装的功能，那们推测，DNMT1 是否也存在于胞浆中，它们之间的结合发生在胞浆中。我们外周血来源的树突状细胞进行了核质分离，分别在胞浆胞核中进行 co-IP 检实验结果证实了我们的猜想。DNMT1 与 eIF3A、eIF3H 之间的相互作用确实在胞浆中，尽管胞核中也存在着 eIF3A，但是两者之间则没有结合。针对 C这个主要在胞核中发挥细胞周期调控的蛋白（胞浆中也有存在），co-IP 检示 CARP1 和 DNMT1 之间的结合则主要发生在胞核中（图 1-3）。

【共引文献】