关于人类肽聚糖识别蛋白的实验研究

发布时间：2020-09-16 18:33

　　实验目的肽聚糖识别蛋白(PGRPs)是一组从昆虫到哺乳动物高度保守的模式识别分子。它们能够识别细菌和细菌独特的细胞壁成分肽聚糖(PGN)。果蝇有13种PGRP基因，被转录成至少17种蛋白质。蚊子有7种PGRP基因，被转录成至少9种蛋白质。以这些基因产物的假定结构为依据，昆虫的PGRPs被分成两大类：短链PGRPs(PGRP-S)，它是一些小的细胞外蛋白质(19-20KDα)，和长链PGRPs(PGRP-L)，它有长的转录本，是细胞间的或跨膜蛋白质。所有昆虫和哺乳动物PGRPs的C端区域氨基酸序列高度保守。此区域氨基酸序列与噬菌体17溶菌酶的氨基酸序列相比，有大约18％氨基酸序列相同，大约33％氨基酸序列相似。噬菌体T7溶菌酶是一种N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，此酶水解PGN的N-乙酰胞壁酸与L-丙氨酸之间的酰胺键。噬菌体T7溶菌酶是一种含有Zn~(2+)的蛋白质，Zn~(2+)是其酰胺酶活性所必需的。噬菌体T7溶菌酶有四种氨基酸序列是它与Zn~(2+)结合及其酰胺酶活性所必需的。至少还有另外3种氨基酸序列是T7酰胺酶活性所必需的。就目前所知的36种昆虫和哺乳动物PGRPs中，其中，12种PGRPs有四个保守的Zn~(2+)-结合氨基酸序列，剩下的另三种氨基酸序列也可能保守，也可能被替代，因而被推测有酰胺酶活性。它们之中的一种，果蝇PGRP-SC1b，最近被证实是一种N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。四种哺乳动物的PGRPs，只有PGRP-L有所有上述保守的氨基酸序列。因此，它被假定为一种酰胺酶。本实验是检测人类肽聚糖识别蛋白(PGRPs)是否具有裂解肽聚糖(PGN)的活性。实验方法一、制备PGRrs重组体和蛋白质目前所讲述的人类PGRP一S，PGRP一L，PGRP一Ia，PGRP一Ip和鼠PGRP一S 克隆于PcDI可A3.1载体，在Cos一细胞中表达。通过PCR制备人类PGRP一L 的缺矢突变体。人类PGRP一L和鼠的PGRP一S的单个氨基酸点突变体是通过clontech(Pal。Alt。，cA)的位点突变试剂盒制备。所有的重组体亚克隆于C一端伴有VS和6XHis标记物的PcDNA3 .1载体上。通过限制性内切酶酶切进行分析，测序。重组体PG盯s蛋白质是通过短暂转染表达重组体 PGRPS的C()S一细胞的裂解物或裂解物和上清液通过使用His一Bind试剂盒 (Novagen，Madison，朋)的亲和层析而获得的。根据生产商的建议，结合液，漂洗液，洗脱液均含有20 mM Tris(PH7.9)，0.SM NaCI，1%Tritonx- 100和分别含有smM，20 mM或300 mM咪哇。这些蛋白质储存于含有 10%甘油的洗脱液，保存在一O“C中。二、检测PGRPs重组体消化肤聚糖(PGN)的能力和酞胺酶活性可溶性未交联的肤聚糖(PGN)是在青霉素G存在的条件下，由生长的金黄色葡萄球菌通过万古霉素一亲和层析获得的。在肤聚糖(PGN)N一端的连接肤链之间的甘氨酸桥上标记有生物素，它的水解反应按目前描述的方法进行检测。溶葡萄球菌素对金黄色葡萄球菌的甘氨酸桥有特异性，能使生物素从PGN上完全丢失。由此证实了生物素实际上是位于这种未交联 PGN的N一端甘氨酸的边界。750ng标记有生物素的PGN与10一SOng PGRP一L，PGF田一I华，PGRP一Ip和PGRP一S及其它们的突变体，在37“C下，共同孵育3天，与10一20Ong的溶菌酶(51脚a，St.肠uis，MO)一起孵育或与溶葡萄球菌素(来源于金黄色葡萄球菌溶血菌素的亲和层析)一起孵育作为阳性对照。与胰酶(来源于Sigma公司的牛胰腺)或与缓冲液一起孵育作为阴性对照。酶消化后的生物素~PGN通过SDS一PAGE，及I~obilon一P免疫印迹。高分子量的生物素一PGN用链球菌抗生物素蛋白一过氧化物(streP- tavidin一pero石dase)和ECL增强的化学发光法来检测。等组分的2讨消化产物用抗一VS抗体作为抗体，用Westem Blot来检测每一种PGRPs蛋白质的存在。三、免疫荧光 Cos7细胞或人类肝纤维母细胞[HepGZ/C3A(灯CC，CRL一10741)〕培养于盖玻片上。用连接于PcDNA3 .1载体上的人类PGRP一L进行短暂转染，免疫荧光染色，无eaZ十和MgZ+的D过beee。’5 PBs洗细胞。用2%多聚甲醛(不渗透细胞，用于细胞表面染色)，或用含0.1%Tritonx一100的2%多聚甲醛(可渗透细胞，用于细胞内染色)4oC固定30分钟，PBs洗。抗一V5 鼠单克隆(5林扩Inl，Invitrogen，Carlsbad，CA)染色，pBS洗，二抗羊一抗一鼠IgG 异硫氰酸荧光素抗体(Sigma)染色，在免疫荧光显微镜下观察。阴性对照组是用空载体转染细胞，按上述方法进行染色。或用连在peDNA3.1载体上的PG即一L转染细胞，只用二抗羊一抗一鼠IgG异硫氰酸荧光素抗体(没有 VS抗体)染色。两种阴性对照组显示相似的低的荧光背景。序列分析:DNA测序和对比。实验结果一、检测PGRPs重组体消化肤聚糖(PGN)的能力和酞胺酶活性 1.结果显示:只有PGRP一L具有裂解肤聚糖(PGN)活性，与溶菌酶和溶葡萄菌素作用相似(阳性对照)。我们制备了缺失PG即I区域的突变体 (醉95一76)和单个氨基酸替代的点突变体。然而，PCRP一Ia，PGRP一Ip及 PG砂一S不具有此活性，与缓冲液或胰酶作用相似(阴性对照)。‘PGRP一L 裂解PGN的动力学效应与溶葡萄菌素的裂解PGN动力学效应相似，比溶菌酶裂解PGN的动力学
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R341
【部分图文】：

聚糖,人类

具有依赖znZ‘的裂解肤聚糖的活性。标记有生物素的肤或与人类PGRP一L、PGRP一a、PGRP一p、PGRp一S、胰酶或与，或与PG砂一L在lmMzn，十存在下孵育。一2小时(B)，或smMEDTA存在下孵育72小时(c)。高分子量的高分estemblots，用链霉抗生物素蛋白和加强化学发光法(E的消化产物也用抗v5抗体通过Westembfots来检测标准物，左面是PGN和各种PGRPS的位置。在溶菌酶30KDa的带。它是溶葡萄菌素，本身能结合抗链霉抗三次相似的实验中获得的。

重组体,渗透性,转染,非渗透性

NOPGRP一LCOntrol组体PGRP一L在细胞中的表达。短暂转染pGRP一L的COS一细细胞中，PGRP一L蛋白质在细胞表面表达(左上图)。在渗透性在细胞内表达(右上图)。它们是使用抗一V5抗体免疫荧光法(下图示转染有空载体(无PGRP~L)的非渗透性细胞和渗透性细四个相似的实验。30

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