激活素A在四氯化碳诱导的小鼠急慢性肝损伤中的作用

发布时间：2020-09-16 12:39

　　 激活素（Activin）是转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员，具有多种生物学活性，在许多器官和组织均具有重要的作用。Activin受体属于丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）激酶型受体，Activin与细胞膜上II型受体（ActRII）结合后，再结合并磷酸化I型受体（ActRI），进而激活下游Smad蛋白，通过Smad蛋白级联反应将信号传导入细胞核，激活相应靶基因。 Activin在肝脏疾病发生发展过程中具有重要作用，研究表明Activin可诱导肝实质细胞凋亡及促进肝星形细胞（HSC）产生细胞外基质等，进而参与肝纤维化的形成。Activin主要包括Activin A、Activin B和Activin AB三种分子形式，Activin A被研究得最多且与肝脏有关。在病毒性肝炎、肝纤维化及肝癌等病变中Activin A表达异常，尤其肝纤维化时可检测到肝细胞中的Activin A表达增加，其可能主要来源于HSC。然而，Activin A及其信号传导蛋白在四氯化碳（CCl_4）诱导的急性及慢性化学性肝损伤中的表达及其作用机制仍未阐明。 本研究为了探讨Activin A在CCl_4诱导小鼠急性及慢性肝损伤中的表达及其作用，采用腹腔注射CCl_4的方法，建立了小鼠急性及慢性肝损伤模型，通过荧光实时定量PCR、免疫组织化学染色以及酶联免疫吸附实验等方法，观察Activin A、激活素IIA型受体（Activin type IIA Receptor, ActRIIA）以及激活素信号蛋白Smads在小鼠肝损伤过程中的表达；通过尾静脉注射抗Activin A及ActRIIA抗体阻断Activin A作用，探讨Activin A在肝损伤时的作用。主要研究内容包括： 一、CCl_4诱导小鼠急性及慢性肝损伤模型制备 1. CCl_4诱导小鼠急性肝损伤模型制备 将适应性喂养7天后的72只C57BL/6小鼠随机分为橄榄油对照组及CCl_4组。橄榄油对照组以10ml/kg体重橄榄油腹腔注射；CCl_4组以5%CCl_4橄榄油溶液（10ml/kg.BW）腹腔注射，于给药后1d、3d、5d和7d各取9只小鼠处死，取血清和肝组织进行检测。通过检测血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平、肝组织HE染色验证肝损伤情况。结果显示，CCl_4给药后1d，肝损伤最为显著，3d、5d及7d肝脏组织损伤逐渐修复。以上结果提示CCl_4诱导小鼠急性肝损伤模型制备成功。 2.CCl_4诱导小鼠慢性肝损伤模型制备 将72只C57BL/6小鼠，适应性喂养7天后，随机分为2组，橄榄油对照组以10ml/kg体重橄榄油腹腔注射；CCl_4组以5%CCl_4橄榄油溶液（10ml/kg.BW）腹腔注射，每周两次（周一和周四），连续六周，于停药后1d、3d、5d和7d各取9只小鼠处死，收集血清和肝组织，进行相关指标的检测。结果显示：CCl_4停药后1d，肝损伤最为严重，masson染色显示肝组织有胶原沉积，随着停药时间延长肝脏组织损伤逐渐修复，但仍有纤维化存在。以上结果提示CCl_4诱导小鼠慢性肝损伤模型制备成功。 二、ActivinA及其相关信号分子在急性及慢性肝损伤时的表达 酶联免疫吸附试验及荧光实时定量PCR检测急性及慢性肝损伤小鼠肝组织中ActivinA水平。结果显示，在CCl_4诱导小鼠肝损伤组织中，Activin A mRNA及蛋白的表达水平升高，在1d、3d时升高最为显著，以后逐渐下降，同时显示血清Activin A水平在肝损伤小鼠也有类似变化，与血清转氨酶水平变化相似，提示Activin A的异常升高可能参与了CCl_4诱导的肝损伤，且与肝损伤程度相关，血清ActivinA水平也可能具有辅助判定肝损伤的价值。 在急性及慢性肝损伤中，ActR ⅡA及Smad3mRNA转录水平也升高，ActR ⅡA及Smad3与Activin A的表达呈正相关，在第7天基本恢复至正常水平。上述结果提示小鼠肝损伤时Activin A信号途径活化可能参与了Activin A介导的急慢性肝损伤过程。 三、抗Activin A抗体和ActRIIA抗体阻断实验 为了确定Activin A在急性肝损伤中的作用，实验采用抗Activin A抗体以及抗ActRIIA抗体阻断内源性Activin A作用及封闭ActRIIA作用，观察对CCl_4诱导小鼠急性肝损伤的影响。利用C57BL/6小鼠建立动物模型，腹腔注射CCl_42h后，尾静脉注射抗Activin A抗体或抗ActRIIA抗体，结果显示：应用抗ActivinA抗体阻断Activin A的作用或应用抗ActRIIA抗体阻断Activin A与IIA型受体结合，血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平均明显降低；HE染色发现与IgG+CCl_4组相比，应用抗Activin A抗体+CCl_4及抗ActRIIA抗体+CCl_4组肝细胞病理损伤程度也较轻。上述资料提示Activin A途径参与了CCl_4诱导小鼠急性肝损伤过程，可能通过抑制肝细胞DNA合成及肝细胞再生，加重CCl_4诱导肝损伤及阻止肝损伤的修复。 综上所述，Activin A高表达可能是加重CCl_4诱导肝损伤的重要因素，Activin A信号途径活化参与了CCl_4诱导小鼠急性及慢性肝损伤过程。因此，阻断ActivinA作用，对预防和治疗肝损伤具有重要意义。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R575;R392
【部分图文】：

CCl4诱导的急性肝损伤模型小鼠肝组织HE染色Fig3.2HEstainingofliverinCCl4-inducedacuteliverinjurymodelmouse5daysCCl4(100×)5daysCCl4(200×)

Cl4诱导的急性肝损伤模型小鼠肝脏组织 ActivinA 免疫组织g3.5 Expression of activin A protein in liver in CCl4-induced acute livmodel mouse assessed by immunohistochemical staining.: Activin A expression was examined by using anti-activin A day after olive oil treatment. C, D: Activin A expression was ei-activin A antibody in liver on 1 day after CCl4treatment. E, Fn was examined by using anti-activin A antibody in liver on 3tment. The procedural background control staining was reprrmal mouse IgG instead of anti-activin A antibody in lived (G) and CCl4-treated (H) mice. Red arrows represent lesiows represent positive staining for activin A. A, C, E, 100×ma

吉林大学博士学位论文3.1.2.2 阻断 Activin A 及 ActR Ⅱ A对肝组织病理损伤的影响HE 染色显示 IgG+橄榄油对照组肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐。G+CCl4组显微镜下显示，肝小叶门脉区有肝损伤病灶及炎症细胞浸润。而抗ctivin A+CCl4组和抗ActRⅡ A+CCl4组均显示肝小叶门脉区损伤减轻（图3.8），一步提示内源性 ActivinA 是介导 CCl4诱导的肝损伤的重要因素。

【共引文献】

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本文编号：2819863