大鼠短间隔连续部分肝切除中再生肝的上调表达基因克隆与功能分析

发布时间：2020-09-16 08:39

　　本论文由4部分内容组成。(1)大鼠短间隔连续部分肝切除中再生肝上调表达基因的克隆与分析；(2)短间隔连续部分肝切除cDNA文库构建；(3)短间隔连续部分肝切除中再生肝特异表达全长cDNA的克隆；(4)短间隔连续部分肝切除模型中肝再生的不同时相与细胞凋亡有关的蛋白检测。肝脏是哺乳动物体中唯一能再生的器官。1931年Higgins和Anderson建立的一次性大鼠大部分肝切除提供了研究肝再生的理想模型，这一模型已在研究哺乳动物组织和器官重建、细胞增殖、分化与去分化、生理生化调控等方面得到了十分广泛的应用。但由于肝再生的复杂性使得人们对肝再生的分子机理迄今了解尚少，为了更好的分析肝再生的分子机理，徐存拴等首次以一次性肝切除后4h(细胞进入去分化期)和36h(细胞分裂高峰)建立了短间隔连续部分肝切除模型(short interval successive partial hepatectomy,SISPH)，该模型以两个肝再生的关键时点为标准来研究肝再生的分子机理，已受到国内外同行的广泛关注和认可。本研究以徐存拴等建立的短间隔连续部分肝切除0-4-40-76-112h为实验模描州大学2皿2年傅士早业论人大民沤间而汪滇邢艾肝勺卜历再生申上们现这基困的兄陆与功讹方析型，应用抑制性消减杂交技术，cDNA文库构建技术，Southern杂交和蛋白质印迹技术与方法，探讨了正常对照和 SISPH实验材料中差异表达的ESTs，全长基因及SISPH各时相周期蛋白和凋亡蛋白的表达，为研究肝再生分子机理提供了新的思路和依据。材料与方法：采用 SISPH模型，以假手术为对照，以 SISPH 112h为处理，用抑制性消减杂交技术（SUppreSSIOll Sllbtf8CtiVe hybndiZati。fi，SSH）研究了 SISpH 模型中差异表达的基因；以SISPH 112h为实验材料，应用RT－PCR 限制性酶切消化，蛋白酶消化，蛋白包装等方法构建了 SISPH 12h。DNA文库；以 SSH文库中的 ESTS 为探针，借助于Southern杂交技术克隆了全长。DNA基因；以SISPH中的 0A叶0刁64 为实验材料，借助于hstern blot技术对各切除时点细胞周期蛋白和凋亡蛋白进行了检测。结果： l、克隆了 9个同源性为 100％EST，44个同源性不等的 ESTs，其中一个与 Genbarik无任何同源性的全新EST，这些上调表达的ESTs序列中，主要包括以下几类：门）与正性、负性急性反应因子或蛋白有关的基因。如血清淀粉样因子A、转铁蛋白、触珠蛋白、a－酸性糖蛋白、纤维蛋白原等，推测这些基因的上调表达与肝再生有密切关系；（2）与线粒体氧化磷酸化有关的基因。如大鼠锚蛋白结合蛋白、线粒体细胞色素氧化酶亚单位1、11、Ill等的上调表达可能是由于SISPH造成肝局部缺氧而使线粒体功能性代偿增生，也表明肝再生过程对能量有更多的需求；NADH：ubiqulnone的上调表达表明依赖于 NADH（苹果酸＋谷氨酸）的能量供应途径在肝再生中的作用更大；（3）与蛋白质合成有关的基因。与小鼠线粒体核糖酶蛋白基因有95％同源性 EST的发现为满足肝再生需要而大量合成iNA，另外核糖体蛋白LS 的表达水平在肝再生中也升高可能为了满足细胞增殖对蛋白质的要求；（4）与细胞分裂相关的基因。如微管结合蛋白合成上调，它不仅是信号传导中的一个靶物，而且是细胞周期调节的一个重要5！擎分子CdC－2激酶的。 2 邓州大学2002卓俗士早业论文大肌厄月隔工人功方肝切阶肝再生申上们表这篡因的丑巨与功止分析靶物：微管结合蛋白还参与细胞有丝分裂中细胞骨架的形成，在细胞增殖中起关键作用：（5）与信号传导相关的基因。如精氨酸酶，它可能参与NO信号通路，共同调节肝再生的信号传导；（6）其它基因。如 T－激肽原，FK506，GABA等。 2、从SISPH 112h CDNA文库中克隆出了 9个 CDNA全长基因，它们在肝再生中的可能作用是：门）LRI基因（GenBank accession No．AF479660）与大鼠甲状腺素结合蛋白基因有73．7％的同源性，肝组织中甲状腺素转运蛋白的上调表达意义有二：（1）打破了肝再生刺激因子与抑制因子的平衡作用，使肝细胞去分化增强；（2）影响酶的诱导与氧
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2002
【中图分类】：R346
【部分图文】：

正向,消减文库

3正向消减文库的建立两次杂交，两次PCR扩增之后，分别得到了对照大鼠和SISPH后112h的正向消减文库，未经消减的对照消减文库(1一C)见图4。可见，实验材料大鼠正向消减文库的分子量介于50一75obP之间，符合构建消减文库的标准。图4正向消减PCR产物分析1.抑制性消减PCR产物;2.非抑制性消减PCR产物;M.小X174旧ae川。Fig.4ForwardsubtraetedPCRProduetsanalysissubtraetedPCRProduets;2.UnsubtraetedpCRProduets.M:中X174/(digestedbyHae川).4cDNA正向消减文库消减效率的鉴定消减文库消减效率的鉴定是判断文库成功与否的关键步骤。分别以抑制性PCR产物和非抑制性PCR产物为模板，用持家基因G3PDHS’、3’为引物进行扩增，分别在18，23，28，33个循环时检测产物

二级库,重组率,兰色,产物

图7LDPCR产物检测1，3为标准分子量，2为LDPCR产物eteetionofIong一distaneePCRPrl，3DNAmarker，Lane2LDPCRProd度和感染宿主菌，我们得到了2.’“p彻ml的二级库，符合建库要个兰色斑，无色斑太多而无法0个，重组率为:(1250一6)/12

效率,重组酶,持家基因,片段

.1探针标记效率检测标记效率的检测所用的对照是持家基因G3PDH，如图9中左边1所示，2为所标记的目的片段，图中右边所示，从效率检测可以看出，所标记的片段可以用于Southern杂交。热鑫纂图9探针标记效率的检测，2分别代表G3PDH和目标片段的探针标记结果Fig.9EffieiencydeteetionofProbe一labeledG3PDHZ，Targetedfragment3.2入噬菌体环化为质粒31’C培养BM25.8时，可激活其体内的cre重组酶活性，cre重组酶可酶切MCS两翼的10xP位点，产?

【参考文献】