原代成体皮肤角质形成细胞、成纤维细胞的培养和转基因研究

发布时间：2020-09-15 12:20

　　目的: 皮肤创伤修复的难点是修复细胞的快速增殖分化、生长因子的持续有序作用和细胞外基质支架的构建。依据现代分子生物学和组织工程学的研究进展,首先在体外克隆及构建带信号肽的人表皮生长因子基因和人血管内皮生长因子基因真核表达质粒,用脂质体转染法将人表皮生长因子基因导入原代离体成人角质形成细胞,将血管内皮细胞生长因子基因导入原代离体成人皮肤成纤维细胞,分别证实转基因细胞表达和分泌hEGF和hVEGF的能力,以达到为皮肤创伤原位修复和人工皮肤构建研究中修复细胞快速增殖、生长因子稳定有序表达目的。方法: 第一章:设计人表皮生长因子(hEGF)基因及其信号肽基因引物,采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)从正常胚胎肾组织总RNA中扩增出hEGF基因及其信号肽基因序列,克隆入pGEM-T载体,质粒抽提后经酶切鉴定和序列分析验证,随后两序列片段经T4连接酶连接后克隆入表达质粒pcDNA3.1(+),再次质粒抽提后经酶切鉴定和序列分析。第二章:采用两步酶消化法对取自成人腹部的全层皮肤组织进行消化,从表皮层中获取角质形成细胞,用无血清培养基Defined Keratinocyte-SFM(DKSFM)传代培养。后以脂质体转染法将质粒pcDNA3.1(+)/hEGF导入角质形成细胞,培养48小时后取细胞作RT-PCR、上清分别进行放射免疫测定和MTT实验。第三章:设计人血管内皮生长因子(hVEGF121)基因引物,从正常胚胎肝组织总RNA中行RT-PCR扩增出hVEGF121基因序列,克隆入pGEM-T载体,质粒抽提后酶切鉴定,后将序列片段重新克隆入表达质粒pcDNA3.1(+),再次质粒抽提后酶切鉴定和序列分析。第四章:采用两步酶消化法从成人腹部皮肤真皮中获取成纤维细胞,以含15%胎牛血清DMEM培养基传代培养。后以脂质体转染法将pcDNA3.1(+)/hVEGF121导入成纤维细胞,转基因细胞培养48小时后取细胞作RT-PCR,上清分别行ELISA检测、MTT实验和Mile’s实验。结果: 第一章:将RT-PCR扩增产物凝胶电泳分别获得约90 bp和180 bp
【学位单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

电泳图,电泳图,序列

体并酶消化鉴定序列和 EGF 序列分别克隆到 pGEM-T 载体, 并进行I 消化后产生 3 kb 和 90 bp 大小的泳带（见图中泳道化后产生 3 kb 和 180 bp 大小的泳带（见图中泳道 3 1-2 RT-PCR 扩增获得人 EGF 及 SP cDNA 序列电泳图M．DNA Marker （DL2000）１．SP cDNA ２，EGF cDNA图 1-3 T-SP，T-EGF 双酶切电泳图M1．DNA Marker（Φ174） M2．DNA Marker（DL2000）

电泳图,电泳图,序列,载体

大小分别为 2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100GEM-T 载体并酶消化鉴定到的 SP 序列和 EGF 序列分别克隆到 pGEM-T 载体, 并进行酶和 EcoR I 消化后产生 3 kb 和 90 bp 大小的泳带（见图中泳道 1、ind Ⅲ消化后产生 3 kb 和 180 bp 大小的泳带（见图中泳道 3、图 1-2 RT-PCR 扩增获得人 EGF 及 SP cDNA 序列电泳图M．DNA Marker （DL2000）１．SP cDNA ２，EGF cDNA

序列,测序,序列

T-SP测序结果与已知序列进行SEQMAN分析

【参考文献】