“形神观”指导下模拟微重力对骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的作用及其机制研究

发布时间：2020-09-18 12:27

　　 研究背景 组织器官的缺血性损伤严重威胁人类的生命健康，其生存率低、预后差，成为临床治疗的一个难题。然而，传统的治疗方法难以从根本上恢复血管内皮细胞的数量和功能，改善组织器官的血流灌注。再生医学近二十年的发展涉及到生物学、材料学、工程学和临床医学等多学科，它为治疗缺血性疾病提供了新的治疗方法。尤其干细胞的研究，近十年取得的突破性进展为再生医学的发展带来了新的机遇。将间充质干细胞应用于再生医学领域治疗各种缺血性疾病，正发挥着巨大的应用潜力。目前，对于间充质干细胞的应用，主要以各种手段将其诱导分化为内皮细胞，而诱导方法主要是通过干/祖细胞的基因修饰、药物作用以及细胞因子的联合运用等手段，尽管这些方法均可以成功实现诱导，但是他们所引起的过度分化问题引起了研究者的关注。对于具有无限分化潜能的间充质干细胞而言，是否能通过改变细胞自身的某些性质，达到提高干细胞诱导效率的目的。但是，目前尚无此类方法的报道。 随着航天事业的发展，人们在空间科学领域的研究取得了一些创新成果，尤其在空间环境的微重力作用下，细胞的增殖凋亡和人体各系统功能均呈现了一定的改变。研究证明，微重力作用下细胞形态和功能改变与其所处的细胞内环境息息相关。而我们的研究发现，微重力刺激后BMSCs的形态由“长梭形”转变为“类圆形”，这种形态的改变具有什么意义呢？中医学的“形神观”阐明了人的形质及由形质构成的形体与生命机能活动的密切联系。形者神之质，神者形之用，形态的变化与其功能的改变是统一的，必然会伴随产生一系列生理或病理变化。微重力刺激后的BMSCs形态的圆形改变，可能是一种原始状态的回归，这种回归将形态结构有序与功能有序相统一，使干细胞处于形神相即的平衡环境中。在这种环境中，BMSCs自身是否具备了更强的分化潜能呢？其向内皮细胞的分化能力又会发生什么样的变化呢？微重力刺激后，细胞形态所呈现的变化影响细胞分化功能的调节机制又是什么呢？据此，我们进行了以下实验研究。 目的： 1.研究BMSCs体外的培养、鉴定和标记方法。 2.观察体外条件下模拟微重力刺激对BMSCs向内皮细胞分化的作用。 3.观察模拟微重力刺激后的BMSCs移植对小鼠缺血下肢血管新生的作用。 4.通过观察模拟微重力刺激后细胞形态的变化对细胞骨架的影响，探讨骨架蛋白相关分子RhoA在BMSCs向内皮细胞分化中的作用。 5.从现代医学角度解释中医理论，寻求细胞形态和功能统一性与中医学“形神观”的契合点。 方法： 1.采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs，观察细胞形态；采用MTT法检测BMSCs的生长和存活能力；应用流式细胞术鉴定细胞表面标志性抗原CD29、CD34、CD45、CD90的表达；并将BMSCs分别用成脂和成骨培养基定向诱导，采用油红O和茜素红染色鉴定分化后的细胞；冻存和复苏BMSCs后，观察其存活率和生长状态；应用DiI标记BMSCs，观察其标记效果和对BMSCs生长状态的影响。 2.将第3代BMSCs随机分为空白对照组（control组）、正常重力培养组（NG组）、2D-clinostat刺激培养组（MMG组）；在微重力和正常重力刺激72h后，将细胞加入内皮细胞的诱导培养液诱导6天，运用倒置显微镜观察细胞形态，分别运用免疫荧光、流式细胞检测、Real-time PCR、Western blot观察诱导后内皮样细胞Flk-1、vWF的表达；ELISA法检测血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子浓度；采用脂质吞噬实验和基质胶血管形成实验检测正常重力和微重力刺激后BMSCs诱导分化的内皮细胞的功能。 3.制备小鼠股动脉结扎下肢缺血模型，将BMSCs分别进行微重力和正常重力刺激72h后应用DiI标记，于股动脉结扎术后1天进行干细胞移植。分别于术后第1d、第21d，使用激光多普勒灌注成像仪检测患肢血流灌注恢复情况。术后21天，处死小鼠。免疫组化HE染色检查组织损伤和修复情况；流式细胞仪检测缺血肌肉中所含DiI阳性细胞数；免疫荧光双染及Western blot检测血管内皮细胞转化效率及vWF的表达量。 4.将第3代BMSCs随机分为正常重力组（0h组），微重力4h组（4h组）、微重力72h组（72h组）和微重力10d组（10d组）。采用倒置显微镜观察细胞形态的变化；流式细胞仪检测细胞凋亡；免疫荧光法检测细胞骨架F-actin的变化。最后，免疫荧光法确定BMSCs中RhoA的定位，并构建RhoA的质粒转染载体，验证其转染效率；将转染成功后的BMSCs进行微重力72h刺激，并进行内皮细胞的诱导，探讨RhoA的活化和抑制对BMSCs诱导的内皮细胞标志物Flk-1、vWF的表达、管腔形成的影响。 结果： 1.通过全骨髓贴壁方法培养的BMSCs贴壁生长，原代培养9～12d可传代，传代后增殖速度增快，P3代细胞已基本纯化。P3代BMSCs呈纺锤形或长梭形，漩涡状排列。经流式细胞仪鉴定，表达CD29、CD90阳性，表达CD34、CD45阴性，符合BMSCs的特征；其能够被诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞；经冻存和复苏后的BMSCs生存率高，达90%和85%，且生长状态良好；应用DiI标记BMSCs的有效率为100%，标记72h后观察发现其荧光显色强度无明显变化，且对BMSCs的生长状态无影响。 2.微重力刺激72h后，加入内皮细胞诱导培养液诱导的BMSCs，可观察到内皮细胞标志物Flk-1和vWF在免疫荧光检测、流式细胞检测、mRNA及蛋白水平的表达明显高于正常重力组。DiI-Ac-LDL吞噬实验、体外血管成形实验的阳性结果也提示诱导后的细胞具备了内皮细胞的功能。 3.对制备下肢缺血模型的小鼠进行微重力刺激后的BMSCs移植，在造模后第21天，与其它组比较，小鼠缺血后肢激光多普勒血流灌注图像指数（LDPI index）改善最为明显。免疫组化HE染色显示微重力组细胞移植对缺血肢体的萎缩和肌肉的坏死损伤显示出明显的保护作用；流式细胞术检测DiI阳性细胞数和免疫荧光双染显示，微重力组移植的BMSCs在体内存活、分化为血管内皮细胞的数目显著高于正常重力组；缺血下肢中vWF在蛋白水平表达增加。 4.微重力刺激0h、4h、72h和10d后，BMSCs形态由梭形向类圆形转变；流式细胞仪检测各时间段细胞凋亡情况无明显差异；免疫荧光检测细胞骨架变化发现，微重力刺激72h时变化最明显，微丝表达明显下降，张力降低。而对于RhoA的表达发现其在BMSCs中主要分布于胞浆和胞膜上；通过构建质粒转染的方式，验证了活化的RhoA可以促进内皮细胞标志物Flk-1和vWF的表达、管腔的形成，而沉默的RhoA则使BMSCs上述生物学行为受到抑制。 结论： 1.本实验采用全骨髓贴壁法成功培养了大鼠BMSCs，并对其进行了分离、纯化和扩增，还对其生物学特性和DiI标记进行了初步研究。 2.微重力刺激后的BMSCs在体外向内皮细胞的分化能力增强。 3.微重力刺激后的BMSCs移植具有更强的向内皮细胞分化和促进血管新生的能力。 4.在微重力刺激72h时，细胞形态发生明显变化，RhoA可能通过调控细胞骨架解聚，从而促进其诱导分化为内皮细胞和血管形成。 5.在中医学“形神观”中“形神合一”观点指导下，微重力刺激后的BMSCs形态的圆形改变使其处于特殊条件下的回归状态中，这种回归为干细胞自身提供了一种圆融、平衡的更适合其分化的环境，从而提高了BMSCs向内皮细胞的分化能力。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R329
【部分图文】：

管新生中的研究现状皮细胞诱导分化的研究壁由内膜、中膜和外膜三层组成。内膜位于管壁的层两层结构。内皮细胞衬附于血管内，以其光滑的层为薄层的结缔组织，具有维持血管壁收缩的作用性纤维两层结构，具有回缩扩张血管、维持张力作有修复能力。内皮细胞在血管生成过程中主要通过样结构[19;20]，从而完成促进血管新生的作用(图 1)十分有限。因此，为了产生血管样结构需要细胞不的内皮细胞成为摆在研究者面前的一道难题。大家试图通过干细胞的分化解决此问题。BMSCs 易于内皮细胞，日益成为促进血管新生中理想的种子细

A（×100） B（×100）图 1-1 BMSCs 细胞形态图A 图为 P0代 BMSCs，可见细胞形态各异，B 图为 P3代 BMSCs，可见细胞形态均一，成旋涡状分布。4.2 BMSCs 的生长曲线BMSCs 在传代后增殖速度较原代明显增快，一般在 7d 左右融合就可达到 8以上。细胞整体生长曲线呈 S 形：以 P3代细胞为例（图 1-2），传代后 1～2d 为伏期，3～6d 处于对数生长期，7～9d 进入平台期。

A（×100） B（×100）图 1-1 BMSCs 细胞形态图A 图为 P0代 BMSCs，可见细胞形态各异，B 图为 P3代 BMSC可见细胞形态均一，成旋涡状分布。Cs 的生长曲线Cs 在传代后增殖速度较原代明显增快，一般在 7d 左右融合就可胞整体生长曲线呈 S 形：以 P3代细胞为例（图 1-2），传代后 16d 处于对数生长期，7～9d 进入平台期。

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 郑红斌;中医形神观源流与内涵[J];浙江中医学院学报;2004年01期

2 何凤;喻陆;童俊容;罗正茂;朱起之;王寅;张建林;;整合素连接激酶在梗阻性肾病肾小管上皮细胞转分化中的作用及尿激酶对其表达调节的研究[J];南方医科大学学报;2009年05期

3 齐乃明;张文辉;高九州;霍明英;;空间微重力环境地面模拟试验方法综述[J];航天控制;2011年03期

4 张喜成;何延政;李跃武;刘勇;陈一尘;;补肾生血胶囊动员骨髓内皮祖细胞促进缺血肢体血管新生的研究[J];江苏中医药;2006年03期

5 刘承宪;21世纪空间生命科学和空间生物技术发展机遇与挑战[J];空间科学学报;2000年S1期

6 李慧杰,李德新;浅释中医形神合一思想内涵[J];辽宁中医学院学报;2004年01期

7 张丽,纪立金;中医学之形神理论及其应用[J];辽宁中医学院学报;2004年02期

8 郭新;漆正宇;秦洁;崔光辉;桂耀庭;蔡志明;;不同基质蛋白对小鼠胚胎干细胞生殖细胞分化相关基因表达的影响[J];中华男科学杂志;2009年11期

9 张尚臣;圆道观哲学思想与中医临证方法论[J];河南中医学院学报;2005年02期

10 董建德;张建;谷涌泉;黄金洪;高峰;李春民;;脱细胞血管基质的生物相容性研究[J];首都医科大学学报;2010年05期

本文编号：2821645